由于缺乏檢測臨床前期生物標志物的工具，包括帕金森綜合征（PD）和阿爾茨海默癥在內的神經退行性疾?。∟DD）的診斷頗具挑戰性。蛋白質錯誤折疊成寡聚體和纖維狀聚集體在NDD的發生和進展中起著重要作用，因此基于結構生物標志物診斷的必要性尤為凸顯。紅外（IR）光譜被認為是一種很有前途的NDD診斷方法，這是由于該方法可以通過無標記且非侵入性的方式提供化學特異性和結構敏感檢測。表面增強紅外吸收（SEIRA）光譜學是一種新興的檢測方法，可擴大紅外光譜的生物傳感能力。

據麥姆斯咨詢報道，近日，瑞士洛桑聯邦理工學院（EPFL）的科研團隊在Science Advances期刊發表了以“Artificial intelligence–coupled plasmonic infrared sensor for detection of structural protein biomarkers in neurodegenerative diseases”為主題的論文。該論文的第一作者為Deepthy Kavungal，通訊作者為Hilal A. Lashuel和Hatice Altug。

這項研究報道了一種免疫分析耦合的納米等離子體紅外超構表面（metasurface）傳感器，可以特異性地檢測與NDD相關的蛋白質，如α-突觸核蛋白（aSyn），并利用其獨特的吸收特征區分不同的蛋白質結構種類。研究人員利用人工神經網絡增強了該傳感器，使其能夠定量預測其混合物中的寡聚體和纖維狀聚集體。而微流控集成傳感器可以在復雜生物基質存在的情況下檢測時間分辨的吸光度“指紋”，并且能夠多路復用以便同時監測多種病理相關的生物標志物。因此，這項研究開發的紅外超構表面傳感器有望成為NDD臨床診斷、疾病監測以及新療法評估的一種有前途的選擇。

光流控等離子體SEIRA的實現，用作結構生物標志物傳感器

圖1A顯示了不同結構的aSyn物種，如存在于路易體（Lewy body）形成途徑上的單體、寡聚體和原纖維。圖1B至圖1E概述了該研究的測量設置以及等離子體SEIRA作為結構生物標志物傳感器的檢測原理。光流控傳感器由放置在含有微流控通道的聚二甲基硅氧烷（PDMS）部件中的等離子體芯片構成。在等離子體內反射（PIR）配置下，從芯片背面收集紅外光照和反射信號，以提取蛋白質二級結構特征，盡管與水性緩沖液吸光度存在重疊（如圖1B）。研究人員將SEIRA與免疫分析法（ImmunoSEIRA）相結合，選擇性地捕獲aSyn物種進行基于結構的區分（如圖1C）。

圖1 ImmunoSEIRA檢測的原理及設置

研究人員在紅外透明氟化鈣（CaF2）襯底上制備了納米等離子體微陣列芯片，其微陣列由三平行組成，其中每行分別包含線性排列的超構表面元件以及用于傳感和定位的金質反射鏡（如圖2A）。隨后，將傳感器芯片放置于PDMS部件中（即芯片單元，如圖2B左所示）。當與芯片單元結合時，這些獨立通道的位置與其對準，三個通道與傳感元件和反射鏡的三行對應重疊。

圖2 光流控ImmunoSEIRA傳感器的構成及三種aSyn的TEM圖像

用于aSyn物種捕獲和光譜分析的ImmunoSEIRA

該傳感器的光譜特異性為基于結構生物標志物的診斷方法提供了固有優勢。但在體液中含有大量生物分子的臨床環境中，靶點選擇性就變得至關重要。因此，研究人員利用SEIRA傳感器結合了免疫分析與光譜學的優勢，使用表征和驗證良好的aSyn特異性抗體來捕獲aSyn物種。免疫分析的工作流程為簡單的三步程序，如圖3A所示。

圖3 用于aSyn物種捕獲和光譜分析的ImmunoSEIRA測定

構象分析區分aSyn的不同結構種類

接下來，研究人員試圖研究該傳感器識別三種aSyn（即單體、寡聚體和原纖維）的二級結構的能力，通過對其酰胺I波段深入分析以進行構象分析。圖4展示了對aSyn單體（i）、寡聚體（ii）和原纖維（iii）的完整分析。值得注意的是，研究人員成功地破譯了寡聚體種類的結構成分（如圖4B），這為在基于免疫分析的診斷工具中使用基于aSyn物種特異性結構的生物標志物鋪平了道路。

圖4 不同aSyn物種的構象分析

AI輔助的ImmunoSEIRA傳感

在患者樣本中，這三種aSyn很可能同時以不同水平存在。因此，亟待開發能夠準確定量每種結構的aSyn（包括寡聚體和原纖維）的新方法。為了確定人工智能（AI）與ImmunoSEIRA相結合的方法能否區分寡聚體和原纖維，研究人員在這里提出了一種測定疾病不同階段樣本中總聚集物存在情況的合理方案，開始時主要是寡聚體，但原纖維逐漸增加，并最終成為混合物中的優勢物種（如圖5A）。

圖5 AI輔助的ImmunoSEIRA可準確預測混合樣本中寡聚體和原纖維的定量存在

值得注意的是，在該DNN分析中，研究人員使用了包括吸收信號微弱及有噪聲的初始時間點在內的原始光譜數據。盡管信號水平較低，在未進行濾波和平均的情況下，該AI輔助的ImmunoSEIRA傳感器表現穩定且對結構敏感。這項性能至關重要，能夠為檢測和量化aSyn寡聚體和原纖維鋪平道路，并且在預期生理濃度較低的縱向研究中，可在疾病進展過程中關聯其比率。因此，提出的新方法能夠更準確地了解蛋白質聚集體在疾病中的作用以及其診斷價值，并且在無需任何人工濾波和其他步驟的情況下，可利用單個樣本進行定量研究。

作為概念驗證，研究人員在檢測來自單個樣本的兩種不同結構的生物標志物蛋白（aSyn和tau）的同時，評估了擴展和復用該ImmunoSEIRA微陣列傳感器的潛力。研究結果如圖6和圖7所示。

圖6 用于注射aSyn或tau原纖維的多路復用ImmunoSEIRA的交叉反應性實驗

圖7 同時注射aSyn和tau原纖維的多路復用ImmunoSEIRA實驗

為使這項研究所開發的傳感器更接近臨床應用，評估其在復雜生物基質中的檢測能力非常重要。為了證明該傳感器的可行性，研究人員使用了通過內部優化方案耗盡aSyn的健康人類腦脊液（CSF）樣本作為生物基質。研究人員觀察發現，牛奶緩沖液是一種合適的阻斷劑，它可以最大限度地減少生物基質中分子或蛋白質的非特異性結合。實驗過程如圖8A所示。

圖8 在復雜生物基質的存在下，病理aSyn原纖維的吸收特征被準確提取

綜上所述，這項研究通過對蛋白質生物標志物的結構分析，探索了SEIRA作為診斷工具的獨特能力。展望未來，研究人員預計，使用血清或血漿等非侵入性且易于獲取的樣本取代腦脊液等侵入性生物液體有望提高新型生物傳感器在PD和NDD診斷中的適應性。

此外，ImmunoSEIRA傳感器的優化有助于實現與患者樣本中蛋白質生物標志物水平相關的所需檢測極限。該二維微陣列等離子體芯片與微流控的兼容性有望為未來研究中提高分析通量帶來優勢。將該傳感器的制備方法轉換為晶圓級方法有望進一步縮短制備時間并降低單個芯片的成本，從而促使SEIRA襯底在未來以較低的價格實現商業化。

從技術角度來看，利用量子級聯激光器、量子級聯探測器以及平面超構光學（meta-optics）等新興紅外技術，從體積龐大的傅立葉變換紅外（FTIR）測量工具轉向高度緊湊型片上中紅外生物傳感器是另一項開放性挑戰。但這也為將新開發的紅外傳感器應用于生物、醫學以及制藥研究與臨床應用開辟了新機遇。

審核編輯：劉清