介紹

準確、快速、無創地檢測和診斷組織中的惡性疾病是生物醫學研究的重要目標。漫反射、熒光光譜和拉曼光譜等光學方法都已被研究作為實現這一目標的方法。漫反射利用組織的吸收和散射特性，特別是細胞核和基質的吸收和散射特性。由于血紅蛋白含量的變化3和新血管形成4，組織變得更加發育不良，組織的散射特性發生變化。熒光光譜也受到組織光學特性變化的影響，并已用于診斷發育不良。然而，這些技術存在許多缺點，包括需要大量樣品制備或切除，以及靈敏度和特異性較低。

許多研究小組轉而使用拉曼光譜來檢測和診斷 體內疾病，而無需去除組織或添加外源性試劑。拉曼光譜是一種基于拉曼散射的方法，是一種強大的技術，可應用于許多組織部位。拉曼光譜是一種分子特異性技術，可探測化學鍵中的振動或旋轉躍遷，并提供有關樣品生化成分的詳細信息。該技術的靈敏度非常高，以至于拉曼光譜實際上是組織生化組成的精確指紋。

我們開發了一種基于探針的拉曼光譜系統，可以在體內非侵入性地獲取拉曼光譜，用于我們的研究。我們小組的總體目標是使用拉曼光譜成功檢測和診斷異常組織，無論患者的年齡、種族、體重指數 (BMI) 或病史如何。已經建立了幾乎相同的系統來獲取拉曼數據以研究各種惡性腫瘤，例如宮頸發育不良、宮頸早產的變化、皮膚癌、結腸癌和乳腺腫瘤邊緣。采集后，拉曼光譜經過校準以考慮日常變化，并進行處理以減去背景熒光和平滑的噪音。最后，進行統計分析以確定拉曼光譜是否能夠診斷惡性區域。

裝置和方法

圖 1 顯示了一個實驗裝置的原理圖和圖片。它由連接到 785 nm 二極管激光器(來自 Process Instruments, Inc. 或 Innovative Photonics Solutions)的 EMVision 光纖探頭、Kaiser Optical Systems 成像光譜儀(Holospec)組成。 ，f/1.8i-NIR)和背照式、深耗盡、熱電冷卻的 Princeton Instruments CCD 相機(PIXIS 256BR)。這些系統均由筆記本電腦使用 Princeton Instruments (Winspec) 提供的軟件進行控制。在大多數實驗方案中，光纖探頭將80 至 100 mW 的光傳送到組織上，積分時間為2-5 秒。測量期間，所有房間燈光和計算機顯示器均關閉。實現了8個波數(cm -1 )的光譜分辨率。

對于這些研究，我們開發了 7-around-1 光纖探頭。激發光纖直徑為 400 μm，每根收集光纖直徑為 300 μm。以下是獲取拉曼數據的典型協議。首先，用干棉簽清潔審訊區域，然后用鹽水清潔。關閉燈后，將拉曼探頭放置在該區域上并進行測量。當所有測量完成后，將探頭擦干凈，放入10% 漂白劑溶液中至少 10 分鐘，然后放入去離子水中5-10 分鐘。

一般來說，獲取拉曼光譜的方案是由研究目標決定的。對于我們的宮頸發育不良研究，數據是從兩組患者群體中獲取的：1)來診所進行篩查的大部分正常人群;2)來診所進行疾病診斷的患病人群。在第一組患者中，清潔子宮頸，然后從子宮頸的三個區域獲取拉曼光譜。光譜與所得病理報告相關，病理報告可以是正常細胞、非典型細胞、低度不典型增生或高度不典型增生。在第二組患者中，患者已經接受過篩查用于宮頸不典型增生，并且具有非典型細胞、低度或高度不典型增生。

圖 1： a) 體內拉曼光譜設置圖示，包括二極管激光器、探針(帶有探針前列的詳細信息)、光譜儀和 CCD 相機。 b) 推車上的系統照片，可供診所使用。注意指向探頭的黃色箭頭。

在此檢查期間，將醋酸放置在子宮頸上，使任何異常區域變白。然后從醫療提供者決定活檢的任何區域以及一個視覺正常區域獲取拉曼光譜。然后進行活檢。該手術的病理結果為陰性、炎癥/化生、宮頸上皮內瘤變 I-III 級 (CIN I-III) 或原位癌 (CIS)。

然后對拉曼數據進行校準和處理，以減去背景熒光并平滑噪聲。這些方法已在前面描述過。在宮頸不典型增生檢測中，稀疏多項邏輯回歸 (SMLR)用于將每位患者的光譜分類為正常、良性、低級別 (CIN I) 或高級別 (CIN II 或 III)。簡而言之，SMLR 是一個貝葉斯機器學習框架，它根據標記的訓練集計算屬于每個組織類別的頻譜的后驗概率。第 1 組使用對每位患者的拉曼測量進行平均的復合光譜。對于第二組，使用每個單獨的光譜，因為它們是從可以與特定病理報告相匹配的不同位點獲得的。

結果與討論

使用拉曼光譜檢測宮頸發育不良一直是我們實驗室正在進行的研究。在我們最初的研究中，光譜是從因良性或惡性疾病而接受全子宮切除術的患者的子宮頸獲取的。在這些研究中，拉曼光譜被分類為正常、良性或惡性，敏感性為89%，特異性為81%。盡管這些結果與使用標準臨床技術時發現的結果相似，但它們沒有提供足夠的證據證明拉曼光譜可以成功診斷宮頸發育不良并易于在臨床中實施。

最近，我們一直在收集上述設置和方法部分中所述的數據，這導致了對500 多名患者的測量。在第一組研究中，從兩個患者組獲取光譜并進行分類，準確率超過 88%。雖然這些結果仍然不適用于臨床，但用于對數據進行分類的方法 (SMLR) 顯示正常數據之間存在很大差異。

進一步的研究集中在尋找這種差異的來源并檢查它們是否影響疾病譜的分類。例如，我們之前的工作表明，差異可能是由于正常月經周期和絕經前后荷爾蒙水平的變化造成的。 此外，疾病的存在會永久改變子宮頸，從而改變從子宮頸獲取的拉曼光譜(圖 2)。在疾病分類之前將這些結果納入 SMLR 算法，將每項研究的分類準確度提高到94%和97%。

圖 2：宮頸不同區域的平均歸一化拉曼光譜。

目前，我們正在研究可能由種族、胎次、社會經濟地位和體重指數引起的差異。我們的初步結果表明，奇偶性，即比較已生育過的女性和從未懷孕過的女性的拉曼測量值，以及體重指數的變化對正常拉曼光譜的色散有顯著影響(正在出版)。正在進行研究，看看考慮到這些變化是否也會導致疾病分類率增加，類似于激素狀態和既往疾病的結果。

由于我們的系統中使用的技術日益復雜，這些細微的變化僅被觀察、解釋并納入疾病分類算法中，以提高敏感性和特異性。具體來說，光纖探頭和CCD 相機是不可替代的組件，它們極大地提高了系統的分辨率，使我們能夠檢測到由于正常患者變化而引起的微小變化。考慮到這些變化使算法能夠專注于檢測疾病引起的變化，從而提高疾病分類率。

未來的方向

雖然本說明的重點是使用拉曼光譜來檢測宮頸發育不良，但我們的研究小組和其他人也利用拉曼光譜來檢測其他組織部位的惡性腫瘤，例如乳房、皮膚、結腸和前列腺。此外，拉曼還被探索作為一種檢測內分泌腺、臨產跡象的子宮頸變化和炎癥性腸病的方法。如上所述，光纖探頭可以單獨使用，也可以插入內窺鏡等臨床工具中，以收集拉曼數據。

拉曼光譜還有許多不同于傳統光纖探頭的用途。空間偏移拉曼光譜 (SORS)已被開發出來，通過分離探針內的纖維來探查更深層的組織。 SORS 已用于骨骼應用和評估腫瘤邊緣。表面增強拉曼光譜 (SERS)依賴于添加金屬表面后拉曼信號的增加，例如將金納米顆粒應用于樣品后。該技術已開發用于體內使用以及拉曼顯微鏡。最后，拉曼顯微鏡提供了更高的分辨率比基于探針的系統可以實現的目標。這些系統中的大多數不能用于體內診斷，但是目前正在進行將顯微鏡的分辨率與拉曼的準確性相結合的方法的研究，例如共焦拉曼光譜。

拉曼光譜有潛力幫助解決醫學界面臨的許多問題。使用優化的設備對于最大限度地成功應用該技術進行疾病診斷至關重要。我們相信，隨著技術的不斷進步，醫療服務提供者將從傳統技術轉向拉曼光譜等光學方法，以提供快速、準確、非侵入性的診斷。

審核編輯 黃宇