RRS的能級過程，分子被入射光激發到電子激發態

拉曼信號十分的微弱。為了讓拉曼技術更加方便易用，許多研究者致力于研究如何增強拉曼信號。拉曼信號增強主要是通過改變樣本制備方式，更改激發方式來實現的，以下是幾種常見的增強型拉曼技術。

一，共振拉曼增強(RRS)

共振拉曼光譜是常規拉曼光譜的一個變種，對于共振拉曼而言，需要仔細挑選激發波長，使得激光光子能量與某個電子躍遷的能量相等或者相近，一般而言位于紫外-可見吸收區域。這種共振將導致拉曼散射的強度增大102-106倍，因此，檢測限會更低，測量時間也會顯著減少。對于一些特殊的應用而言，共振拉曼的益處很多，一個典型的例子是利用共振拉曼來分析環境污染物，通常，共振拉曼可以檢測到濃度低至ppm～ppb范圍的微量污染物。

當激發光波長小于270nm的時候，分子會被激發到激發到電子激發態的高層態，然后當發生熒光時，分子會先通過非輻射躍遷弛豫到電子激發態的底層，再向下躍遷產生熒光。而對于拉曼過程，不存在由非輻射躍遷過程，因此拉曼信號的波長比熒光信號的波長短，因此可以使用濾光片有效的去除熒光信號的影響。此外，對于大生物分子，共振吸收通常會發生在大分子的某一個官能團，這里稱之為發色團。因而RRS可以實現對大分子中某個發色團的研究而不被周圍其他分子影響。

不過由于RRS的激光光源一般是采用紫外光，所以對整個系統的玻璃材質，鍍膜都會有特殊需求，所以相對成本較高，此外并且紫外激光器相對更大型、更復雜，也更加昂貴，目前紫外拉曼實驗依然屬于高端技術，需要高水平專業技術人員操作。最后由于紫外光子的能量更高，在紫外激光照射下樣品更易于燒壞或者降解，生物樣本也更容易產生變異。下圖是RRS的簡要優缺點對比圖：

二，表面共振增強型拉曼(SERS)

SERS是一種非常靈敏的探測技術，它能夠顯著的增強微弱的拉曼信號，允許在極低的樣品濃度下探測樣品的存在、結構等。

SERS使用通常的拉曼光譜法測定吸附在膠質金屬顆粒如銀、金或銅表面的樣品，或吸附在這些金屬片的粗糙表面上的樣品。SERS現象首先是由英國科學家Fleischmann在1974年發現的，當時他發現吸附在粗糙的銀電極表面的吡啶拉曼信號增強。1997年學者Kneipp與Nie成功的實現了單分子級別拉曼探測，從此SERS成為了非常流行的探測技術。

SERS的增強原理

SERS能夠提高拉曼信號主要是有兩個機制，一是電磁場增強，一個是化學增強。電磁場被認為是最主要的增強貢獻，當激光入射到金屬納米顆粒的時候，會發生等離子效應，在納米顆粒周圍的電場會顯著增強，因而附著在納米顆粒表面的待測分子的拉曼信號就會因此顯著提高。電磁場增強效應可以提高拉曼信號約1萬倍。由于Cu, Ag和Au 3種IB族金屬的d電子和s電子的能隙和過渡金屬相比較大, 在可見光與近紅外激光激發的情況下，它們不易發生帶間躍遷。便可避免因發生帶間躍遷而將吸收光的能量轉化為熱等, 從而趨向于實現高效SPR散射過程。因而Cu, Ag和Au是目前最主要使用的SERS基質金屬。對于化學效應，待測分子與金屬發生了電荷轉移，從而更改了待測分子的能級結構，可以實現共振激發，提高拉曼信號?；瘜W效應可以提高拉曼信號約10-100倍。

由于SERS技術可以顯著的提高拉曼信號的強度，因而SERS技術對于激發光源，探測器的要求就會大幅度降低。這使拉曼設備的小型化成為了可能。如下圖是濱松生產的SERS模塊C13560，它的尺寸只有80*60*12.5mm3，重量只有80g，相比于其它重達幾十千克的科學拉曼設備，C13560具有非常高的便攜性，非常適合那些對便攜性要求高的場合，比如毒品檢測，污水檢測等。

SERS技術的核心關鍵就是SERS基質的制備。SERS基質的主要問題包括有信號增強不均勻，基質壽命短，成本高等缺點。因此目前SERS基質發展主要是有兩個方向：1是提高增強的均勻性，2是降低成本，降低基質制備要求與制備時間，實現基質的立等可取。對于前者，目前采用的主要手段是納米印刷技術，可以實現金屬納米顆粒高度均勻的分布，從而可以實現高度均勻的拉曼增強，此外介質的壽命也可以做到長達半年。對于后者目前主要的手段分為兩種，一種是采用打印技術，將納米顆粒溶液放到打印機的墨盒中，可以將納米顆粒打到印到紙張上，可以非常高效率的完成SERS基質的制備。還有一種是基于電流位移的技術。在金屬片比如鋁片上涂上還有銀離子的溶液，鋁會把銀離子還原，從而銀就以比較粗糙的形式附著在了金屬片上。這兩種制備方法都具備實驗條件要求低，成本地，速度快，立等可取的優點。從另外一個角度解決了SERS壽命短的問題。

三種SERS基質制備技術的對比

三，針尖增強拉曼技術(TERS)

TERS實際上也是基于表面等離子增強效應。不過與SERS不同，TERS并不是使用粗糙的金屬基質來增強拉曼信號，而是使用一根靠近樣品的極細的金屬針尖來增強針尖附近的拉曼信號。

TERS系統的基本結構

TERS技術一般是基于原子力顯微鏡搭建的。通過將原子力顯微鏡(AFM)的針尖包覆SERS活性金屬或金屬納米粒子(Ag, Al, Au等)使其具有SERS活性，那么SERS增強效應將可望只在針尖附近很小范圍發生。TERS實驗通常需要將激發激光束通過標準的顯微鏡物鏡聚焦，從而產生在衍射極限0.5 ~ 1.0微米范圍內尺寸的光斑(具體大小依賴于激發激光波長和所使用的物鏡);然后使具有SERS活性的針尖與激光光斑范圍內的樣品接觸。

這里主要有兩種類型的拉曼散射過程：

1.來自衍射極限0.5 ~ 1.0微米激光光斑范圍內的常規拉曼散射。

2.來自針尖的表面增強拉曼散射(即針尖增強拉曼散射)。

由于SERS給出的拉曼強度增強可高達1014-1015倍，那么TERS強度可以認為遠超過常規拉曼信號強度。因此可以認為拉曼信號僅僅來自于針尖附近的樣本。因此在光斑范圍內掃描針尖的移動，就可以得到光斑內的顯微拉曼。由于針尖的尺度一般都小于100 nm，所以這種測量的空間分辨率也將相應地小于100 nm，從而實現真正納米尺度的拉曼。當然，因為與常規拉曼分析相比，TERS所取樣的分子數目相應地也減少了幾個數量級，所以并不能保證所有的樣本都可以成功的實現TERS。下圖展示了TERS基本的實驗構型與針尖的大小。

TERS可以具有可以實現單分子探測，具有很高的分辨率(<100nm)的優點，但是因為TERS一般需要與AFM相結合，系統比較復雜，因此應用一般局限在實驗室中，而不能像SERS一樣有機會發展為手持設備。此外TERS技術所用的針尖也容易損壞，表面鍍的活性金屬液容易脫落，進一步提高了TERS實驗的難度。下圖總結了TERS的優缺點：

四，相干拉曼散射技術(CRS)

與前面幾種拉曼增強技術只使用一個波長激發不同，CRS技術需要使用兩個波長的光源對樣本進行激發。CRS也可以大概提高信號106倍，目前已經成為一種常見的非線性顯微技術。

CRS分為兩種類型，一種是相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)，另外一種是受激拉曼散射(SRS)。在CRS技術中，兩束頻率分別為wp與ws的光在空間上重合然后通過物鏡匯聚到樣本上。當兩束光的頻率差與分子振動的能級相同的時候，就會發生CARS與SRS過程，對于CARS過程，兩束光與樣本相互作用，產生頻率為2wp-ws的CARS信號。而對于SRS過程，兩束光與樣本相互作用，wp的能量會轉移到ws光上。下圖為CARS與SRS過程對應的能級圖：

CRS的能級過程，與自發拉曼不同，CRS需要兩束入射光

雖然CRS可以顯著的提高拉曼信號強度，但是相比于普通熒光信號，受激界面仍然較弱，因而激光光源常采用飛秒、皮秒光源來提高收集效率。為了提高穿透深度，光源一般采用近紅外光，所以摻鈦藍寶石飛秒激光器+OPO等超快光源是主流的CRS光源。

對于CARS技術，由于CARS信號仍然較微弱，所以產生的信號一般是經過濾光片濾除激發光以后直接使用PMT進行探測，由于CARS信號一般位于600-800nm區間，所以具有較好的可見與紅外響應的多堿，GaAsP類型的PMT成為CARS技術的首選PMT,比如濱松的R3896，H7422p-40等。

而對于SRS過程，由于SRS信號本身與激發光源的波長一致，所以無法使用PMT進行探測，為了能夠實現探測，常采用的方法是基于調制器與鎖相放大器的調制與解調方法。以使用816nm與1064nm激光探測生物樣本中油脂的SRS實驗為例[見下圖]。使用電光調制器或者聲光調制器調制1064nm激光的強度，調制頻率為20MHZ，則由于SRS過程，在經過了樣本之后，816nm的強度也發生了調制(有1064nm時，816nm強度減弱，沒有1064nm時，816nm強度不變)，調制的深度即為SRS信號的強度。經過帶通濾波片使用光電二極管探測816nm信號，然后將二極管探測的信號輸入到鎖相放大器，就可以得到816nm的調制深度，從而得到SRS信號的強度。

SRS技術的實驗裝置與SRS信號探測的方法

CRS技術非常適合用于顯微成像，可以實現視頻級的速度。不過由于CRS一次成像只是得到一個波數的圖像，因此更適合那種拉曼峰特別明顯的樣本。如果想要得到與顯微拉曼類似的數據(每個像素都包含有拉曼光譜)，則需要掃描兩束及發光的波長差，則CRS的時間優勢會變得稍微不明顯。下面是CRS技術的優缺點：

審核編輯 黃宇