體內拉曼光譜學

拉曼光譜是生命科學和生物技術中一項重要的測量技術，涵蓋從分析單一生化分子結構的納米級實驗到疾病檢測和組織性質監測。生命科學研究中的拉曼光譜學家在紫外(UV)到近紅外(NIR)和短波紅外(SWIR)區域使用激發和檢測，激光激發波長的選擇是平衡光譜分辨率、檢測效率和避免自熒光背景的重要實驗參數。

近年來，拉曼光譜在臨床和體內光譜中的應用顯著增長，因其在監測疾病、惡性組織檢測、冠狀動脈鈣化和炎癥方面的診斷潛力已被證明。拉曼光譜的一個顯著優勢是速度快且能夠進行無標記測量。結果通常在幾秒內即可獲得，分子特異性極高，無需特殊樣品制備或光學標記。

自發拉曼散射是一種弱效應，僅影響十分之一的現象6-108入射光子，需要能夠探測極低信號水平的靈敏相機。不幸的是，生物組織上的應用往往無法通過增加激光功率來補償，因為組織可能會被大量激光輻射損傷。因此，正確選擇用于檢測拉曼信號的相機對于體內拉曼測量至關重要。

近紅外的高靈敏度

體內組織上的拉曼測量會受到自發熒光干擾的影響，這會遮蔽弱拉曼信號并使測量分析變得復雜。緩解自熒光的主要工具是選擇更長的(近紅外)激發激光波長，將拉曼信號轉移到自熒光背景影響較小或消失的光譜區域。

最常用的激發選擇是785nm或830nm激光，這兩者同時伴隨著組織中散射減少的窗口，從而實現更大的光學穿透深度。由于拉曼信號是作為相對于激光線的能量變化被檢測到的，相關光譜信息將位于近紅外波長范圍內。

靈敏度檢測的挑戰在于，隨著接近1100納米的探測極限，基于硅的探測器在近紅外的量子效率正在下降。此外，自發拉曼散射截面以1/λ的速率衰減。4與可見光激勵相比，信號強度顯著降低。鑒于這些挑戰，正確選擇檢測系統對于體內拉曼光譜應用至關重要。

用于近紅外波長區域的首選探測器是深度耗盡CCD，這是一種帶有更高近紅外靈敏度的背光傳感器。其耗盡區寬度明顯大于普通背光CCD，提高了在需要較長平均自由程以實現吸收和檢測的紅波段的效率。

最近，超深耗盡相機(有時稱為HiRho CCD)發布，其近紅外靈敏度更高。圖1展示了深度耗盡“標準”CCD相機與超深度耗盡高近紅外高靈敏度相機在波長增加下量子效率的比較。

圖1：CCD相機在體內拉曼光譜學中的量子效率。條形圖分別顯示了785納米(淺藍色)和830納米(橙色)拉曼光譜相關的光譜區域。綠色區域代表重要的指紋區域。

讓我們來看看這種效率如何應用于785nm和830nm激發波長的拉曼光譜實驗，特別是在拉曼信號可能出現的光譜帶內。圖1顯示兩條條，顯示拉曼信號在785nm(藍色條)和830nm(橙色條)激發下的光譜位置。指紋區域在500-1500厘米之間-1每個案例都用綠色高亮顯示。它對應的波長為817-889nm(785nm激發)，865-948nm(830nm激發區)。

當需要進一步降低自體熒光背景時，830nm激光激發是一種選擇，相較于785nm激發。然而，信號高波數區域的邊緣(2500-3800cm)-1)部分位于硅CCD探測器探測范圍之外的波長(硅CCD探測器無法探測波長超過1100納米的光，這對應于> 2900厘米的830納米激光的能量偏移-1).

InGaAs探測器可用于該波長范圍的檢測，但代價是噪聲增加了幾個數量級。事實上，對于自發熒光干擾最強的應用，有些實驗甚至使用約1064nm的更高激發波長，以進一步將期望信號與干擾背景的光譜區域分離。

由于信號位于硅(Si)CCD無法探測的紅外波長，因此應使用深冷卻的InGaAs相機。使用液氮或先進熱電冷卻的深度冷卻能有效減少熱噪聲，從而提升InGaAs相機的靈敏度。

從圖1可以看出，標準的深耗攝像機以及更高近紅外靈敏度的攝像機都非常適合高效檢測拉曼信號的指紋區域。然而，后者為拉曼光譜中所有相關區域提供了更好的高靈敏度覆蓋。

低噪聲與深度冷卻

弱信號要求光譜相機在低噪聲水平下工作，尤其需要較低的讀數和暗噪聲。設計良好的相機電子設備會將讀出噪聲控制在最低水平。暗噪聲是由每個像素中熱產生的電荷以及傳感器上入射光產生的電荷產生的。暗噪聲還會在信號中引入偏置，隨著曝光時間的延長而增加，從而增加信號中的噪聲。

光譜相機通常通過垂直分組檢測器排來作。分幀在讀出前，在串行寄存器中收集列中每個像素(即所有對應相同波長的電荷)的電荷(因此讀出噪聲只累積一次)。然而，在分選過程中，列中每個像素的暗電荷也會累積。由于通常需要分組數十甚至數百個探測器行，暗電荷的有效積累量可能比相機數據手冊中按像素計算的數值大出數量級。因此，用于體內拉曼光譜的靈敏相機應能在極低溫度下工作，以避免傳感器上積累暗電流。

在體內應用中，最常用熱電冷卻，以避免處理低溫液體。最新一代深層熱電冷卻相機可在-75°C至-95°C之間，無需任何外部設備(如液冷循環或冷卻器)。

除了熱電冷卻設計外，相機傳感器腔體的良好真空對于實現低溫也非常重要。吸塵器在運行時應無需維護，且壽命長，理想情況下應能貫穿相機的使用壽命。

低固定模式噪聲與防折邊技術

Etalon化是由傳感器中光線干涉引起的。當檢測到的波長大于700nm時，背光CCD相機中就會發生這種現象，因為探測材料(硅)在1100nm處接近檢測極限時變得更透明。Etaloning會表現為傳感器上一系列干涉條紋，在圖像和光譜上都能看到。

對于體內拉曼光譜學，這些伊拉曼效應進一步復雜化了生物系統所顯示的背景減法和數據分析。理想的體內拉曼光譜探測器需要減少或消除這些效應。

針對CCD相機傳感器這些缺陷的傳感器增強已被廣泛應用，不僅可以消除無向化，還能擴大和提高傳感器的光譜靈敏度。

例如，Teledyne Princeton Instruments eXcelon 工藝設計旨在消除 etalon(見圖2)，并打造超寬帶高靈敏度 CCD 攝像機。它顯著提升了量子效率高達40%，量子電子流>從紫外到可見光的量子效率達到90%。eXcelon的設計還旨在為研究人員提供比單層或兩層AR涂層更高的性能選擇。

圖2：使用eXcelon(右圖)相較于標準背照CCD(左圖)和兩幅圖像的截面，均改善了邊緣化效果。用900nm單色光照明。

基于eXcelon技術的成功，專門為近紅外拉曼應用，特別是體內拉曼光譜開發了一種名為eXcelon 4的新型CCD增強工藝。eXcelon 4在用785nm和830nm激光激發的拉曼測量中，從低波數和指紋區到高波數區，提供了理想的抑制。

探測器尺寸

體內拉曼測量通常使用光纖探針，探針以圓形或線性排列的纖維束。這種布置使光纖端部在信號收集側形成密集排列，并沿光譜儀入口狹縫分布在光譜儀/探測器側(見圖3)。

圖3：圓到線性纖維叢。輸入和輸出側的特寫視圖。

這種配置增加了覆蓋大面積光纖的信號收集，并優化了與光譜儀的耦合效率，同時可保持高光譜分辨率進行測量。(參見我們的技術說明：提升拉曼散射的收集效率)

圖4展示了通過此類光纖束采樣的原子發射燈光譜的色散圖像。纖維在垂直方向上的線性排列清晰可見。

纖維叢的不同區域可能具有不同的光譜功能。例如，空間偏移拉曼光譜(SORS)利用組織側纖維的空間排列，從地下組織區域獲得深度依賴數據。

用于體內拉曼光譜的理想探測器應具備足夠大的寬度和高度，以覆蓋寬廣的光譜范圍且分辨率足夠高，并且光纖束能夠容納大量光纖。光譜CCD如Teledyne、普林斯頓儀器的BLAZE和PIXIS攝像機系列，擁有寬27毫米和高8毫米的高傳感器選項，尺寸足夠容納數十條高光譜分辨率的光纖線路。需要注意的是，這種探測器應與全焦平面像差低(如散光)的光譜儀配合使用。否則，光譜質量和分辨率將因像差的引入而降低。

圖4：光譜學使用纖維束。光纖沿入口狹縫分布，提高了光耦合效率，同時保持高光譜分辨率。

摘要

用于體內診斷測量的拉曼光譜必須應對弱信號和大熒光背景輻射的挑戰。由于深度耗盡和HiRho CCD相機在近紅外中靈敏度高，是該應用的理想探測器。最新一代相機針對體內測量進行了優化，增加了以下特別硬件組件：

先進的熱電冷卻系統可達到低至-95°C的溫度，無需冷卻器或液體冷卻劑

傳感器增強以消除光譜數據中的無光化和邊緣化現象

大型傳感器以幫助最大化信號收集，并實現高光譜分辨率

審核編輯 黃宇