圖 1. 在流式細胞儀中，熒光標記的細胞在流中單列通過，并受到幾種不同波長的激光照射。產生的熒光在分離成不同的波長帶后進行檢測。

多波長激光引擎將激光源與預對準和穩定的自由空間聚焦光學器件或集成光纖傳輸系統相結合，簡化了熒光顯微鏡專家和流式細胞儀 OEM 的對準和集成任務。

如今，生命科學領域成功應用的大多數光子學技術都基于某種形式的熒光檢測。這些技術包括研究人員用于活細胞成像的共聚焦顯微鏡、為臨床血細胞計數儀器提供動力的流式細胞術、DNA 測序儀等。

這些應用通常受益于使用多個激發波長。在熒光顯微鏡中，這允許用戶激發各種目標，包括傳統染料、基因表達的熒光蛋白和初始細胞內容物。在神經科學中，光遺傳學技術使用一個波長來模擬或沉默目標神經元，而第二個波長通過熒光鈣指示劑映射互連神經元中的反應。該方法最大限度地減少了激活和成像通道之間的串擾。流式細胞術通常使用多個波長進行多參數計數和/或分類。這意味著使用幾個波長分離的熒光染料信號通過單個儀器分析細胞或其他生物顆粒。

這些不同的應用都具有一個共同的需求，即以微米或更高的精度聚焦、塑造和定位多束激光。越來越多的“激光引擎”滿足了這一需求，它將光源與高度穩定的自由空間聚焦光學器件或集成光纖傳輸系統相結合。對于 OEM 和最終用戶來說，這可以降低成本、避免耗時的光學對準程序、縮短開發時間并提高儀器的穩定性和可靠性。

多參數流式細胞儀激光引擎

激光引擎最初是為流式細胞儀開發的，流式細胞儀是基礎研究中常用的儀器，用于進行血細胞計數以及對畜牧業和養魚業的精子或胚胎進行分類。在流式細胞術中，熒光標記的細胞或其他小目標被迫以單行流的形式流過流動池(見圖 1)。它們穿過幾束激光束的相互作用區，這些激光束被整形并聚焦成像梯子上的橫檔一樣排列的長線。產生的熒光和散射被收集起來，并通過二向色濾光片和帶通濾光片分離成波長帶，然后再進行檢測。一些高性能研究儀器可以有 100 多個獨立的探測器。

第一批激光引擎為流式細胞儀制造商提供了使用多種激光波長的更好途徑。然而，這些最初的激光引擎只是由多個單獨的激光器組裝而成。這不可避免地造成了冗余，因為每個激光器都有自己的控制器、接口和機械外殼。此外，它們是在面包板上構建的，因此用戶或儀器制造商必須提供并對齊可調節的光學元件和支架。

第二代激光引擎直接針對 OEM 儀器制造商。它們的特點是小型化并使用多個激光核心。這意味著所有激光器都使用單個驅動電路板、接口和電源，并且全部包含在一個緊湊的外殼內。

這種類型的激光引擎包括光束整形和組合，每個激光器的焦點和指向都通過簡單的螺旋式調節裝置(每個自由度一個)獨立控制。這些產品中的第一款提供了流式細胞儀中最常用的四種波長的選擇：405 nm、488 nm 和 640 nm，還有可選的 561 nm(見圖 2)。

圖 2. 在第二代激光引擎中，暫時移除裝飾性的外殼(插圖)，以便對最多四種激光波長進行獨立的光學調節。

如今，研究儀器制造商通常會整合兩個激光引擎，以便獲取從紫外線 (UV) 到 640 nm 的多達八種波長。這樣，使用一臺儀器就可以對多達數十種不同的數據參數進行細胞計數。

微型光學元件、更低的成本、卓越的穩定性

流式細胞儀的應用范圍不斷擴大，從研究到個性化醫療，再到追蹤 COVID-19 等疾病的傳播和進展。市場需求也促使儀器制造商縮短開發時間、減小臺式機型號的尺寸、降低成本并延長維護間隔。

激光制造商正通過第三代激光引擎來支持這一趨勢。它們基于微型光學元件，實現了更小的整體封裝、卓越的穩定性和更高的經濟性。

要實現封裝尺寸的減小，需要兩個關鍵的設計創新。第一個就是從一開始就使用直徑較小的光學元件。這是有道理的，因為內部激光束直徑小于 1 毫米。因此，沒有令人信服的理由使用過去常用的 0.5 英寸直徑透鏡(約 13 毫米)及其相關的笨重支架。

其次，新引擎不使用傳統的光學支架。這些傳統支架由多個獨立的金屬部件、撓曲件和螺釘組裝而成。因此，由于熱循環和環境振動，它們在長期使用中不可避免地會出現偏移。

最新的激光引擎采用了一種最初為密封腔內激光器使用而開發的安裝技術。它被稱為 PermaTrack，其光學元件支架被取消。相反，光學元件在制造過程中對齊并永久粘合到穩定的基板上。由于沒有單獨的機械部件，它們在正常使用過程中不可能移動。

這種安裝技術成功地消除了流式細胞儀現場維修的主要原因之一：激光重新校準，這對儀器制造商和用戶都有好處。此外，由于這項最新的激光引擎技術基于生產過程中的自動化(即機器人)組裝和校準，因此它提供了更好的單元間一致性。

無需打開激光引擎進行重新校準，這帶來了另一個重大好處。它允許外殼密封，這樣內部組件就不會暴露在灰塵或可能從有機材料中釋放出的化學物質中。此外，還包括主動“吸氣劑”，以進一步保護原始環境。這種方法是為工業應用提供長壽命密封可見光和紫外激光器的同一種方法的改編。

實際上，工廠校準和密封的激光引擎配置了四條(或三條)光束，通常采用交錯聚焦線排列。盡管 OEM 可以指定不同的幾何形狀，但整個行業中這些線的相對分離已經變得相對標準化。使用可調聚焦光學元件可以在三維空間中調整光束階梯的位置，以適應儀器組裝中各個單元之間的差異。

為顯微鏡用戶提供即插即用系統

同樣的理念也應用于熒光顯微鏡，這種技術幾乎見于每個生命科學研究實驗室——從大學到制藥廠。將多種激光波長引入這些顯微鏡的集成解決方案已經問世一段時間了。

最常見的做法是通過光纖耦合來實現。這樣可以避免光學器件和相關硬件使顯微鏡直接空間變得雜亂。但這也意味著必須將多個激光器對準光纖，然后將它們全部耦合到顯微鏡的單個輸入光纖中。

對于熒光顯微鏡，通常首選單模光纖，因為這樣可以提高效率并實現清晰聚焦(更高分辨率)的樣品激發。但典型的單模光纖的纖芯直徑在 8.0–10.5 μm 范圍內。使用具有五六個自由度的傳統光纖耦合支架將激光束對準這種尺寸的光纖纖芯非常耗時。即使是經驗豐富的技術人員也可能需要幾個小時才能完成每臺激光器的這項任務。

一旦實現了對準，在使用過程中以及長期內，仍存在著維持必要的微米級對準度的問題。操作儀器和環境溫度的正常變化很容易使其失去對準度。此外，使用二向色濾光片、偏振器和波片來組合波長也是一個挑戰。

激光制造商已經通過類似于光學總線的緊湊型模塊解決了這個問題。這些模塊將多個光纖耦合激光源的輸出組合成一根單模光纖，為顯微鏡供電。用戶通過八個特定波長的光纖端口提供輸入，這些端口使用卡入式連接器。輸出是一條光纖，在整個 405-640 nm 范圍內具有恒定的數值孔徑 (NA)，無需用戶進行任何調整。

如今，緊湊而智能的固態激光器幾乎像燈泡一樣易于操作。這使得生命科學研究人員和儀器制造商能夠專注于他們的工作，而不是激光調整。這反過來又導致了熒光方法在實驗室和臨床環境中的普及。激光引擎的不斷發展提供了同樣輕松訪問多種波長的能力，這將繼續為熒光技術帶來光明的未來。

審核編輯 黃宇