乳腺癌（BC）是女性最常見的惡性腫瘤。在BC的四種亞型中，三陰性乳腺癌（TNBC）因其侵襲性強、易轉移、預后差、易復發、易耐藥等特點，生存率明顯低于非轉移性亞型。同時，TNBC缺乏廣譜的標記受體。因此，尋找合適的生物標志物進行早期診斷和不同亞型的檢測對癌癥治療至關重要。

近期，吉林大學超分子結構與材料國家重點實驗室徐抒平課題組報道了機器學習輔助表面增強拉曼光譜學（SERS）用于基于微液滴的單細胞分析檢測，相關成果以“Single-Cell Analysis and Classification according to Multiplexed Proteins via Microdroplet-Based Self-Driven Magnetic Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Platforms Assisted with Machine Learning Algorithms”為題發表在國際化學權威雜志Analytical Chemistry上。

該研究構建了一種基于微液滴-表面增強拉曼光譜（microdroplet-SERS）的單細胞檢測平臺，并開發了單細胞異質性分析和不同BC亞型分類的工作流程。單細胞與捕獲探針（免疫磁珠，iMBs）和報告探針（immuno-SERS標簽，iSERS tags）一起被包裹在微液滴中。在微液滴中，觀察到iMBs的一種獨特的界面定向聚集（IOA）效應，即帶負電荷的細胞膜傾向于吸引電中性捕獲探針（iMBs）自發地向細胞膜表面聚集。進而外泌體蛋白和iSERS tags會被生物偶聯在iMBs上，形成三明治夾心結構，通過對iSERS標簽的SERS信號采集實現對外泌體蛋白的分析。實驗中分析了3種外泌蛋白（FAK、CD9、CD63），因而制備了3種報告分子標記的iSERS tags。iSERS tags在iMBs上的富集產生的熱點效應對SERS信號的放大極為有利。

圖1 基于微滴的自驅動磁SERS平臺輔助機器學習算法工具的基于多重外泌體蛋白的單細胞分析和分類的原理圖

實驗中對iMBs聚集到細胞膜表面的動態過程進行監控。可觀察到5分鐘之內iMBs可以聚集在細胞膜表面。對25個液滴內的細胞表面的iMBs數量統計顯示出較好的一致性。進一步地，液滴內的細胞在裂解液的作用下釋放游離的外泌體蛋白并被iMBs捕獲，并與iSERS tags形成免疫三明治結構，進而進行SERS檢測。圖2C為三次實驗的細胞外泌體蛋白的檢測結果。

圖2 （A）動態監控磁珠聚集過程；（B）不同單細胞表面磁珠的數量；（C）三次平行實驗的結果

對獲取到的兩種細胞系的光譜數據進行降維和聚類處理，分組聚類熱圖和降維算法可以很好的區分兩種細胞系。聚類分析顯示出4種亞群，這與蛋白的表達特征有關。

圖3 （A）兩種細胞系三種蛋白水平的分組聚類熱圖；（B）聚類分析；（C）t-分布隨機鄰域嵌入（t-SNE）降維散點圖；（D-F）三種蛋白的水平分布

利用隨機森林分類模型可區分兩種BC細胞系，其中訓練集和測試集都顯示了良好的準確率。采用受試者工作特征曲線（ROC）評價分類器的準確率，曲線下面積（AUC）值為0.938，接近于1，表明該分類器性能良好。

圖4 隨機森林分類模型以及對模型的評估：（A）隨機森林錯誤率矩陣；（B）用訓練集測試分類器；（C）分類器用測試集進行測試，單位為%；（D）分類器的二分類ROC曲線；（E）利用MDA和MDG指數對三個變量的重要性排序

綜上所述，該研究建立了一種基于微液滴的表面增強拉曼光譜方法，用于單細胞水平分析外泌體蛋白。該方法的關鍵是界面定向聚集效應，可以通過聚集被探測細胞膜表面的捕獲探針來收集目標蛋白和報告探針，使分散的蛋白富集到檢測點，同時通過形成熱點來放大信號，以提高液滴內檢測靈敏度。基于該平臺的檢測靈敏度可以達到單個細胞的外泌體蛋白檢測的要求。此外，該研究引入了機器學習算法，用于發現單細胞數據集中不同亞群的存在，并分析不同蛋白質之間的關聯。基于單細胞數據集，該研究發現了不同亞群的不同性能特征，證實了單細胞存在明顯的異質。





審核編輯：劉清