惡疫霉（Phytophthora cactorum， P. cactorum）是一種壞性極強(qiáng)的植物病原真菌，草莓植株感染惡疫霉會引起革腐病和冠腐病。統(tǒng)計(jì)表明，感染惡疫霉草莓植株果實(shí)產(chǎn)量平均下降20%~30%，部分可達(dá)50%，嚴(yán)重影響草莓果實(shí)產(chǎn)量。因此，惡疫霉已成為草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要病害。

由于草莓惡疫霉缺乏低成本的治療手段，快速準(zhǔn)確診斷該病原真菌對預(yù)防由其引起的疾病擴(kuò)散、控制疾病、減少種植戶的損失具有重要意義。目前，常規(guī)的診斷方法有組織分離法、顯微鏡分析法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、擴(kuò)增（聚合酶鏈反應(yīng)和重組酶聚合酶擴(kuò)增）、熒光原位雜交、酶聯(lián)免疫法等。其中，組織分離法培養(yǎng)成本低、過程簡單，且可以實(shí)現(xiàn)活菌的定量檢測，但是檢測時(shí)間長、準(zhǔn)確度低；顯微鏡分析法需要復(fù)雜的設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，費(fèi)用高且耗時(shí)長；免疫學(xué)檢測主要研究抗原與抗體的特異性反應(yīng)，操作簡單、反應(yīng)速度快；分子雜交和PCR擴(kuò)增的檢測特異性強(qiáng)、靈敏度高，可在病害未顯現(xiàn)癥狀或癥狀不明顯時(shí)作出準(zhǔn)確診斷，反映病害發(fā)生的嚴(yán)重程度；但是草莓植株早期感染惡疫霉分布不均勻、含量較低，導(dǎo)致分析樣本量大，無法及時(shí)且準(zhǔn)確地診斷。

Jellen等和Eikemo研究草莓植株感染惡疫霉后有機(jī)揮發(fā)性氣體隨時(shí)間的變化，發(fā)現(xiàn)感染惡疫霉的草莓植株會散發(fā)出獨(dú)特的有機(jī)揮發(fā)性氣體4-乙基苯酚（20 ℃蒸汽壓0.13 mmHg）和4-乙基-2-甲氧基苯酚4-乙基愈創(chuàng)木酚（25℃蒸汽壓0.017 mmHg），而且有機(jī)揮發(fā)性氣體濃度與感染惡疫霉的嚴(yán)重程度成正比，濃度變化范圍分別為1.12~22.56 mg/kg和0.14~1.05 mg/kg。由于有機(jī)揮發(fā)性氣體4-乙基苯酚濃度遠(yuǎn)高于4-乙基愈創(chuàng)木酚濃度，因此可以選擇4-乙基苯酚作為草莓惡疫霉感染的特征性氣體。

半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器具有成本低、功耗低、體積小、靈敏度高、易于集成等優(yōu)點(diǎn)，可以有效克服氣相色譜-質(zhì)譜、高效液相色譜等分析方法的不足，非常適合用于農(nóng)業(yè)環(huán)境中有機(jī)揮發(fā)性氣體的實(shí)時(shí)監(jiān)測。氣體敏感材料是半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器的核心，直接影響其檢測4-乙基苯酚的性能。半導(dǎo)體單壁碳納米管（Semiconducting Single-Walled Carbon Nanotube，SWNT）可看作是由單層石墨烯按照一定的方向卷曲而成，直徑為幾納米、長度為1~100 μm量級的一維中空管狀結(jié)構(gòu)，具有高表面吸附能力、良好的導(dǎo)電性和電子傳輸特性，是一種優(yōu)異的氣體敏感材料。但是，SWNT制備的半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器選擇性差且靈敏度低，無法實(shí)現(xiàn)對4-乙基苯酚的特異檢測。

卟啉是由四個吡咯環(huán)通過亞甲基連接在一起形成的大分子雜環(huán)化合物，每個吡咯環(huán)由4個碳和1個氮組成，位于大環(huán)內(nèi)部的所有氮原子形成一個中心空腔，可以與幾乎所有的金屬離子配位形成金屬卟啉絡(luò)合物（Metalloporphyrin，MPs）。由于MPs的配位金屬離子處于不飽和狀態(tài)，使得氣體分子可以在MPs軸向位置通過范德華力、氫鍵與中心金屬離子相互作用，改變其自身光學(xué)或電學(xué)性能。因此，MPs可以改變卟啉分子中心金屬離子的種類、環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及周圍取代基類型來調(diào)控氣體響應(yīng)的靈敏度和選擇性，實(shí)現(xiàn)對特定氣體的檢測。

為實(shí)現(xiàn)草莓疫霉果腐病早期快速診斷，本研究將SWNT沉積在場效應(yīng)管，進(jìn)而在SWNT表面修飾金屬卟啉提升場效應(yīng)管制備氣體傳感器的靈敏度和特異性。依據(jù)不同金屬卟啉對4-乙基苯酚敏感差異，篩選出檢測靈敏度高的半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器的最優(yōu)檢測參數(shù)，提升在草莓疫霉果腐病早期診斷的實(shí)用性。

2

材料和方法

2.1試劑與材料

半導(dǎo)體性單壁碳納米管（SWNT，0.01mg/mL，95%）購自美國NanoIntegris公司；丙酮、異丙醇、氫氧化鈉、氨水購自Fisher Scientific公司（中國）；3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane：APTES，99％）購自美國Acros Organics公司；4-乙基苯酚購自上海麥克林公司（中國）；二甲基甲酰胺（Dimethylformamide，DMF）采購自北京化工有限公司（中國）；金屬卟啉（tetraphenyl porphyrin （TPP）， iron porphyrin （FeTPP）， zinc porphyrin （ZnTPP）， copper octamethyl porphyrin （CuOEP）and manganese OEP （MnOEP））均由西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司（美國）和百靈威科技有限公司（美國）提供。

2.2試驗(yàn)儀器

拉曼光譜利用物質(zhì)分子對入射光所產(chǎn)生的頻率發(fā)生較大變化的散射現(xiàn)象，檢測和識別分子的震動（聲子）狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)使用532 nm激光激發(fā)，通過Nicolet Almega XR色散顯微鏡測量；紫外-可見光光度法使用180~780 nm的單色光輻射的吸收或反射強(qiáng)度來進(jìn)行物質(zhì)的定量、定性或結(jié)構(gòu)分析，實(shí)驗(yàn)使用Beckman DU800紫外/可見分光光度計(jì)（Beckman Coulter公司，美國）采集；掃描電鏡圖像由Zeiss Leo SUPRA 55獲得，光束能量為10 kV；電化學(xué)性能測定，包括電流-電壓（I-V）和電流-時(shí)間（I-T），由半導(dǎo)體參數(shù)分析儀（Keithley 2636）進(jìn)行分析；高精密天平BSA224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；氯苯類富集柱采樣管采購自譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司（中國）；Direct-Q8超純水機(jī)（美國Millipore公司）；實(shí)驗(yàn)室管式電熱爐YG-1206（上海煜志機(jī)電設(shè)備有限公司）。

2.3氣體傳感器制備

間隙場效應(yīng)管制作參考文獻(xiàn)：將表面覆蓋100 nm SiO2的硅晶片分別置于丙酮、異丙醇和乙醇中各超清洗20 min，祛除表面有機(jī)污染物，氮?dú)獯等埩粼噭还杈砻嫘空怨饪棠z，后通過曝光、顯影將間隙電極圖形印制在光刻膠表面；采用電子束蒸發(fā)鍍膜機(jī)在光刻后的基底表面依次蒸鍍20 nm鉻膜和180 nm金膜，并置于300 ℃的恒溫環(huán)境中熱處理增強(qiáng)鉻金層間的黏附性；最后，將熱處理后的硅晶片放入丙酮溶液中浸泡12 h，溶解光刻膠，獲得源極和漏極的間隙長寬各10 μm。

間隙場效應(yīng)氣體傳感器修飾步驟如圖1所示。分別用丙酮、異丙醇和氨水清洗電極，祛除掉表面有機(jī)和無機(jī)殘留物；將場效應(yīng)管源極和漏極浸入APTES中30 min，超純水洗掉表面殘留；間隙場效應(yīng)管浸入單壁碳納米管溶液中60 min；使用超純水清洗場效應(yīng)管表面殘留的單壁碳納米管，并置入250 ℃管式氣氛爐內(nèi)，祛除單壁碳納米管表面的活性劑；將不同MPs溶解到二甲基甲酰胺（1 mg/mL），SWNT-FET浸入MPs溶液中4 h，最后在惰性氣體保護(hù)條件下，90 ℃退火60 min。

圖1半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器制備示意圖

Fig.1 Schematic diagram of semiconducting field effect gas sensor

2.4氣體發(fā)生器

圖2所示為有機(jī)揮發(fā)性氣體稀釋裝置，利用特定溫度下固體粉末4-乙基苯酚產(chǎn)生揮發(fā)性氣體飽和蒸汽，通過控制氣體質(zhì)量控制器調(diào)節(jié)空氣流量和4-乙基苯酚有機(jī)揮發(fā)性氣體飽和蒸汽的混合比例，產(chǎn)生不同濃度的4-乙基苯酚蒸汽；進(jìn)而在氣體管道中混合后，通過在氣體傳感器1.2 cm3的密封玻璃罩。使用Keithley 2636作為數(shù)據(jù)采集設(shè)備，通過三個電極線（柵極、源極和漏極）與半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器相連接，源極和漏極施加可施加電壓范圍-0.1~ +0.1 V，柵極施加電壓0 V，記錄電流信號隨著有機(jī)揮發(fā)性氣體濃度變化。

圖2有機(jī)揮發(fā)性氣體稀釋裝置

Fig. 2 Organic volatile gas dilution device

2.5信號分析

由于不同的MOEP-SWNT/FET初始電阻存在差異，影響檢測精度，為此本研究采用相對電阻（Relative resistance）變化作為響應(yīng)信號，如公式（1）和（2）所示。

其中，R0為MnOEP-SWNT/FET放置在干燥空氣中的原始電阻，Ω；R為MnOEP-SWNT/FET暴露在VOCs的電阻值，Ω；為源極和漏極間的電壓，V；為源極和漏極之間的電流，A。

半導(dǎo)體材料載流子遷移率μ的計(jì)算如公式（3）所示。

其中，和表示場效應(yīng)管源極和漏極間的長和寬，m；為轉(zhuǎn)移電導(dǎo)（IDS /VG的斜率），A/V；VG為基極電壓，V；為柵極電容，nF/cm2，此處取11.6 nF/cm2。

3

結(jié)果與討論

3.1MnOEP-SWNT表征

利用拉曼光譜研究MnOEP修飾SWNT/FET前后變化，結(jié)果如圖3（a）所示。半導(dǎo)體單壁碳納米管的拉曼光譜在1351 cm-1（D Band）、1579 cm-1（G Band）、1600 cm-1（G+ Band）和2680 cm-1（2D Band）處顯示出四個峰。MnOEP修飾半導(dǎo)體單壁碳納米管后，G帶峰變窄，G帶位移至1598 cm-1，以及D/G強(qiáng)度比增加，表明MnOEP與SWNT通過非共價(jià)鍵結(jié)合，SWNT表面部分sp2轉(zhuǎn)化為sp3。

圖3Bare SWNT（黑色）和MnOEP-SWNT（紅色）的光譜特性

Fig.3 Spectral characteristics of Bare SWNT （black） and MnOEP SWNT （red）

紫外-可見分光光度計(jì)研究SWNT和MnOEP修飾到間隙場效應(yīng)管表面，為克服Si/SiO2透光性差，選擇透光性好的石英玻璃替代Si/SiO2。空白的石英玻璃吸收光譜作為基準(zhǔn)值，圖3（b）所示SWNT被固定到石英玻璃表面后，在200~800 nm范圍內(nèi)的吸光度顯著增強(qiáng)且200~400 nm之間有明顯的吸收峰，這與SWNT的特征吸收峰相符合，表明SWNT通過APTES的共價(jià)鍵很好的固定到石英玻璃的表面；當(dāng)MnOEP修飾SWNT后，MnOEP-SWNT的吸收光譜明顯高于Bare SWNT，并且在475和560 nm處有微小的吸收峰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)相符合，表明MnOEP修飾到了SWNT表面。

圖4SWNT/FET修飾MnOEP前后電化學(xué)性能變化

Fig. 4 Changes of electrochemical properties of MnOEP modified by SWNT/FET

如圖4（a）所示電化學(xué)分析方法表征MnOEP修飾SWNT/FET的導(dǎo)電性能變化。SWNT/FET和MnOEP-SWNT/FET的IDS-VDS曲線呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，但MnOEP-SWNT/FET導(dǎo)電性顯著降低，表明MnOEP與SWNT間相互作用發(fā)生電子轉(zhuǎn)移并形成π-π鍵。圖4（b）可知SWNT/FET的柵極閾值電壓（VTH）為0.45 V，MnOEP修飾SWNT/FET后，F(xiàn)ET曲線向負(fù)方向移動，VTH值為-5.3 V。根據(jù)遷移率計(jì)算方程，可知SWNT/FET和MnOEP-SWNT/FET的遷移率分別為525和387 cm2/Vs。MnOEP-SWNT/FET導(dǎo)電性變差的原因［26］：MnOEP和SWNT之間發(fā)生電子/電荷轉(zhuǎn)移，p型半導(dǎo)體SWNT/FET的空穴被MnOEP提供的電子占據(jù)，導(dǎo)致MnOEP-SWNT/FET的載流子濃度低、遷移率低。

3.2參數(shù)優(yōu)化

圖5顯示了不同金屬卟啉制備的半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器對不同濃度4-乙基苯酚的飽和蒸汽的相對電阻。SWNT/FET對1%、10%和100% 4-乙基苯酚飽和蒸汽的相對電阻分別為0.1、0.24和0.49。當(dāng)SWNT/FET修飾不同MPs后，半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器靈敏度變化為MnOEP-SWNT/FET > ZnTPP-SWNT/FET > CuOEP-SWNT/FET > TPP-SWNT/FET > FeTPP-SWNT/FET，表明MnOEP特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)對4-乙基苯酚具有較高的選擇性。因此，MnOEP被選擇為半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器的氣敏材料。

圖5不同MPs-SWNT/FET檢測4-乙基苯酚飽和蒸氣性能對比

Fig.5 Performance comparison of different MPs SWNT/FET for detecting saturated vapor of 4-Ethylphenol

圖6顯示了MnOEP-SWNT/FET的相對電阻變化與濃度和時(shí)間的關(guān)系。由圖可知，MnOEP-SWNT/FET檢測1%、10%和100%的4-乙基苯酚飽和蒸汽，在低濃度條件下，MnOEP-SWNT/FET的相對電阻與檢測時(shí)間呈正相關(guān)，且在5 min時(shí)達(dá)到最大值；在高濃度條件下，MnOEP-SWNT/FET的相對電阻達(dá)在2 min達(dá)到最大值，之后保持恒定值。因此，選擇5 min作為半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器的檢測時(shí)間。

圖6MnOEO-SWNT/FET暴露在不同濃度的4-乙基苯酚飽和蒸氣中相對電阻與時(shí)間的變化

Fig. 6 Changes of relative resistance and time of MnOEO-SWNT/FET exposed to saturated vapor of 4-Ethylphenol at different concentrations

圖7SWNT/FET和MnOEP-SWNT/FET的電壓-電阻變化（VG=0 V）

Fig.7 Voltage resistance change of SWNT/FET and MnOEP-SWNT/FET （VG=0 V）

源極和漏極之間電壓（VDS）是半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器的重要參數(shù)之一。圖4（a）中IDS-VDS采用歐姆定律計(jì)算不同電壓下的電阻，如圖7所示。在0 V的不連續(xù)性主要是由于信號采集設(shè)備的精度不足，無法高精度采集超微電流信號；在其它電壓下，SWNT/FET和MnOEO-SWNT/FET的電阻值沒有變化，表明電壓變化對電阻無影響。因此，任何電壓可作為VDS，本研究選用0.1 V。

3.34-乙基苯酚檢測線性關(guān)系

為研究氣體傳感器的線性檢測范圍和最低檢測限，在最優(yōu)化檢測條件下，SWNT/FET和MnOEO-SWNT/FET分別檢測不同濃度的4-乙基苯酚飽和蒸氣5 min，不同濃度間隔使用干燥空氣清洗10 min。圖8（a）顯示了SWNT/FET和MnOEO-SWNT/FET在VDS=0.1 V和VG =0 V時(shí)，依次對氣體發(fā)生器產(chǎn)生的0.25%~100%的4-乙基苯酚飽和蒸氣的相對阻抗變化，可知MnOEO-SWNT/FET相對阻抗隨著4-乙基苯酚飽和蒸氣濃度增大而增大。從圖8（b）的線性圖可以看出，MnOEO-SWNT/FET的相對電阻在4-乙基苯酚飽和蒸氣在0.25%~20%的濃度范圍內(nèi)變化較快，而在20%~100%的高濃度范圍內(nèi)增長緩慢，但都呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為：

線性回歸相關(guān)系數(shù)分別為0.9411、0.9745，檢出限為0.15%的4-乙基苯酚飽和蒸氣（S/N =3）。

圖8場效應(yīng)氣體傳感器對不同濃度4-乙基苯酚飽和蒸氣的響應(yīng)變化

Fig. 8 Response of field effect gas sensor to saturated vapor of 4-ethylphenol with different concentrations

3.4一致性

為研究傳感器的一致性，采用上述方法制備了4個MnOEP-SWNT/FET，用于檢測不同濃度的4-乙基苯酚飽和蒸氣，如圖9所示。對比不同MnOEP-SWNT/FET檢測相同濃度的4-乙基苯酚后的相對電阻變化，相對電阻與4-乙基酚濃度呈正相關(guān)且變化趨勢一致，各濃度下的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）均低于10%，表明MnOEP-SWNT/FET具有良好的一致性。

圖9不同MnOEO-SWNT/FET檢測4-乙基苯酚飽和蒸氣后相對電阻變化

Fig. 9 Change of relative resistance after detecting saturated vapor of 4-ethylphenol with different MnOEO-SWNT/FET

3.5實(shí)際樣本分析

為驗(yàn)證MnOEO-SWNT/FET分析實(shí)際樣本中4-乙基苯酚的濃度效果，實(shí)驗(yàn)選用氯苯類富集柱采樣管分別富集健康草莓植株（1和2）和惡疫霉感染草莓植株（3和4）的揮發(fā)的有機(jī)揮發(fā)性氣體。采集的有機(jī)揮發(fā)性氣體使用MnOEO-SWNT/FET進(jìn)行分析，進(jìn)而與4-乙基苯酚飽和蒸汽等體積1:1混合，分析結(jié)果如表1所示。經(jīng)過分析可知，MnOEO-SWNT/FET檢測草莓健康有較小的信號，存在假陽性，主要由于半導(dǎo)體氣體傳感器易受到環(huán)境干擾；對草莓感染植株，MnOEO-SWNT/FET檢測信號較為明顯大于10% 4-乙基苯酚飽和蒸汽濃度，使用MnOEO-SWNT/FET診斷具有較高準(zhǔn)確率。

表1 MnOEO-SWNT/FET檢測草莓健康植株和感染植株

Table 1 Detection of healthy and infected strawberry plants by MnOEO-SWNT/FET

4

結(jié) 論

有機(jī)揮發(fā)性氣體4-乙基苯酚是診斷草莓惡疫霉感染的氣體標(biāo)志物，其濃度與草莓植株感染惡疫霉嚴(yán)重程度直接相關(guān)。采用半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器檢測4-乙基苯酚，可以有效克服傳統(tǒng)組織分離法、顯微鏡分析法、PCR擴(kuò)增技術(shù)、熒光原位雜交、酶聯(lián)免疫法等診斷的不足，具有操作簡單、使用方便、分析低成本等優(yōu)點(diǎn)。

本研究利用金屬卟啉的配位金屬離子處于不飽和狀態(tài)，使得氣體分子可以在MPs軸向位置通過范德華力、氫鍵與中心金屬離子相互作用，改變半導(dǎo)體單壁碳納米管的靈敏度和選擇性，篩選出對4-乙基苯酚靈敏度高且選擇性好的金屬卟啉MnOEP，并且與SWNT和FET聯(lián)用制備半導(dǎo)體場效應(yīng)氣體傳感器。經(jīng)過分析可知，MnOEO-SWNT/FET對有機(jī)揮發(fā)性氣體4-乙基苯酚具有較高的選擇性、靈敏性及響應(yīng)時(shí)間，能夠?qū)崿F(xiàn)對草莓植株感染惡疫霉準(zhǔn)確的診斷，但是對于健康草莓植株診斷存在假陽性。

針對本研究MnOEO-SWNT/FET易受待測環(huán)境中溫度、有機(jī)揮發(fā)性氣體的干擾，因此需要探究可變溫度和多氣體耦合對MnOEO-SWNT/FET的響應(yīng)信號干擾規(guī)律，提出解耦合干擾方法，提高M(jìn)nOEO-SWNT/FET在復(fù)雜環(huán)境中檢測4-乙基苯酚的精度。

審核編輯 黃宇