用于連續監測生物分子濃度的傳感器對于在病人護理、工業流程以及環境安全和可持續性方面開發基于生化的監測和控制策略是必需的。傳統的生物傳感器具有宏觀的感測區域，例如電極或光學探測的表面積，收集的信號源自大量分子集合的相互作用，而無法解析單分子層面的相互作用。近年來，傳感器已經被微型化，并且開發出了由微型傳感器陣列組成的傳感器，其中每個單獨的傳感器都足夠小，能夠解析由單分子相互作用引起的轉變。本文用于研究由單分子分辨率傳感器陣列組成的連續傳感器中的功能異質性，通過將傳感器暴露于分析物濃度變化（增加和減少）超過長時間跨度（25小時）。 該方法是一種基于數千個生物功能化粒子與生物功能化感測表面相互作用的連續生物傳感技術。揭示了異質性是由粒子和表面上親和力分子數量的隨機波動引起的，并且響應特性的逐漸變化與單粒子傳感器中分子的逐漸損失有關。結果表明了顯著的分子和時間異質性，并提供了如何為單分子分辨率的連續親和力基礎生物分子監測設計、精確和穩定的傳感器的思路。

近日，來自荷蘭埃因霍溫理工大學復雜分子系統研究所（ICMS）W. J. Prins團隊，在《Advanced Science》雜志發表了題為“How Highly Heterogeneous Sensors with Single-Molecule Resolution can Result in Robust Continuous Monitoring Over Long Time Spans”的文章。該研究對具有單分子分辨率的生物分子傳感器由大量傳感器組成，這些傳感器測量與單分子結合和解離事件相關的態變化。傳統上，為了獲得足夠的統計數據，會從許多單獨的傳感器中聚合信號。然而，通過聚合信號，傳感器之間的差異會丟失，異質性也無法被研究。在這里，我們研究了長時間跨度內具有單分子分辨率的傳感器，這使得可以從獨立的傳感器中收集足夠的統計數據。這允許比較傳感器，揭示了它們分子組裝中與隨機變化相關的基本異質性。該研究是通過粒子運動生物傳感進行的，這是一種與數千個粒子動態與感測表面相互作用的傳感方法。在25小時內，對分析物濃度的一系列調制中，研究了單個粒子的信號。這些結果提供了對具有單分子分辨率的連續傳感器的分子和時間異質性的見解，并解釋了如何設計傳感器以實現穩健、精確和穩定的生物分子監測。 本文主要關注了如何在基本的單分子層面上研究、理解和利用基于親和力的傳感器的功能特性。將為實現能夠長時間跨度內精確和穩定監測生物分子的傳感器的工程策略和設計奠定基礎，以滿足廣泛的應用需求。

圖1基于親和力的生物分子結合轉化為測量信號的傳感過程

傳感器分為三類：i) 基于集合的傳感器，ii) 具有單分子分辨率的傳感器組合，以及 iii) 具有單分子分辨率的單個傳感器探測。具有單分子分辨率的轉導方法能夠區分和計數單個單分子結合和解離事件。劑量-反應關系通常通過聚合單分子數據和許多單獨傳感器組合信號來建立。組合增加了測量數據的統計量，然而，平均過程會導致關于異質性的信息丟失，例如分子之間的差異、分子相互作用之間的差異以及傳感器之間的差異。 作者深入研究了具有單分子分辨率的傳感器之間的差異，以研究變異性并理解高度異質性傳感器如何能夠在長時間跨度內實現穩健的連續監測。BPM被用作模型系統（圖1B）。BPM是一種利用生物功能化的微米級粒子作為具有單分子分辨率的傳感器的生物傳感方法。粒子的運動特性受到粒子和感測表面之間可逆親和力單分子相互作用的影響。在實驗中，粒子通過柔性的雙鏈DNA系繩附著在基質上，將每個微米級粒子限制在傳感器表面上的亞微米級區域。使用寬場光學顯微鏡實時測量每個粒子的運動軌跡。 ? 圖2在BPM傳感器中探測單個粒子，以獲得25小時內的單粒子響應 本研究中使用的實驗設置將粒子被固定在流動池內的表面上，該流動池連接到一個定制的流體系統，用于長時間跨度的自動化流體交換。作者使用了一個基于競爭的BPM傳感器進行測量，該傳感器旨在連續監測小分子（糖苷生物堿）。粒子與分析物類似分子的結合導致粒子的運動自由度減少，即粒子從未結合狀態轉換為結合狀態。粒子的視頻圖像被實時處理，以定位每個粒子的x和y位置作為時間的函數。然后分析運動軌跡以確定切換事件和粒子的相應時間依賴狀態。10個分析物濃度-時間曲線系列在25小時內順序應用于單個流動池，每個系列由8個不同分析物濃度的流體應用組成。在每次流體應用后跟蹤粒子15分鐘（圖2B）。在高分析物濃度下，活動低，因為粒子主要處于未結合狀態，因為抗體被分析物分子占據，很少與感測表面上的分析物類似物結合。黑色曲線顯示了粒子集合的平均響應，與溶液中分析物濃度呈負相關，這符合基于競爭的傳感器的預期（圖2B）。有趣的是，單個粒子的響應（紅色）顯示出高度的變化：不同的粒子顯示出明顯不同的行為。這些差異可能由時間和非時間異質性引起。時間異質性與單個粒子在結合和未結合狀態之間轉換的時間點的隨機性有關。三個選定粒子的DRCs，分別為它們的第一個濃度系列（左）和所有十個濃度系列的時間平均（右）。根據粒子集合的平均響應，一些粒子確實顯示出S形曲線，但令人驚訝的是，粒子也顯示出鐘形曲線（圖2C）。

圖3對具有不同數量的粒子端結合分子（NPSB）和基質端結合分子 一個競爭性的基于粒子的傳感器被建模為具有NPSB（粒子端結合分子，PSBs）與溶液中的分析物分子以及感測表面上的NSSB（基質端結合分子，SSBs）相互作用。顯示了不同數量的粒子結合分子和恒定數量的基質結合分子（NSSB = 10）的模擬時間軌跡示例（圖3B）。突出顯示了兩個時間依賴的粒子屬性：PSBs和SSBs之間形成的鍵的數量（左y軸，紅色曲線）和觀察到的粒子狀態（右y軸，灰色曲線）。當沒有PSB-SSB鍵時，粒子狀態為未結合，當至少有一個PSB-SSB鍵時，粒子狀態為結合。圖3C顯示了單鍵時間分數，即在只有一個PSB-SSB鍵時，粒子在單鍵狀態下花費的平均時間分數。對于少量的粒子端結合分子，隨著基質端結合分子數量的增加，單鍵時間分數增加。然而，對于大量的粒子端結合分子，由于形成了多個鍵，該分數減少。圖3D顯示了對劑量-反應關系的影響，粒子切換活動繪制在y軸上。對于少量的結合分子，DRC呈現S形，并且隨著結合分子數量的增加，曲線向右移動。

圖4利用信號-時間曲線的相位對單粒子響應特性進行分類

不同顏色表示不同的區間，在4A和4B兩個面板中均有顯示（圖4A，4B ）。數據顯示不同的相移區間與不同的DRC特征相關，從無響應（暗紅色）到S形（橙色）到鐘形（綠色）。作者在本研究中，開發的分類方法可以研究粒子如何在長時間跨度內改變它們的DRC特征。結果也顯示了粒子在25小時內如何改變它們的DRC特征（圖4C，4D）。頂部面板與最初（在t = 0時）在面板A和B的橙色區間內的粒子有關，在所有面板中，紅色曲線表示第一個DRC（在0到2.5小時之間測量），藍色曲線表示最后一個DRC（在22.5到25小時之間測量）。頂部面板的結果表明，最初具有S形DRC的粒子在25小時內保持相同的DRC形狀和相同的相位偏移，而信號的幅度隨時間減少。底部面板顯示，最初具有鐘形DRC的粒子將其特征轉變為S形DRC（具有較低的相位偏移）。具有鐘形DRC的粒子具有大量的結合分子和多價相互作用，因此失去結合分子將增加具有單價鍵的可能性，因此將DRC向S形特征轉移。 在粒子與表面之間的結合主要由單價鍵主導的區域中進行的測量和模擬可以用來估計傳感器中結合分子的損失率。在單價結合區域，粒子具有S形DRCs，觀察到的活動速度逐漸以每小時約1.6 ± 0.2%的速率減少（圖4C）。 文章鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202412181 ? ? ? 審核編輯 黃宇