圖 1： FCS 成像系統。光聚焦在一定的體積內，當熒光團移入激光檢測體積時可以觀察到分子動力學。改編自 DKFZ_FCS。

介紹

熒光相關光譜 (FCS) 可測量由于對目標熒光團的任何物理、化學或生物效應而產生的熒光強度波動。原則上，光聚焦在樣品的某個區域，并測量該區域的熒光強度的波動。熒光強度的這種波動可能是由各種動力學引起的，包括粒子的布朗運動。布朗運動是液體/氣體中的分子由于與環境中其他快速移動的粒子碰撞而發生的隨機運動的術語。這會導致粒子(在本例中為熒光粒子或熒光團)位置的隨機波動。

對某個區域的 FCS 分析返回該區域中熒光團的平均數量以及它們穿過該區域時的平均擴散時間。可以進一步分析該數據以了解熒光團大小、熒光團濃度、溶液粘度和擴散系數。 FCS 是一種極其靈敏的分析工具，因為它能夠測量小體積內極少量的分子(納/皮摩爾濃度)。

FCS成像系統

典型的 FCS 成像系統由激光作為激發源。激光聚焦在樣品的特定區域，穿過激光焦點體積的熒光分子被激發并發出熒光。發射的熒光通過物鏡返回并被靈敏的科學相機檢測到，如圖 1所示。收到的數據通常是隨時間變化的熒光強度，但可以通過相關分析進行進一步分析。

相關性

為了查看兩個變量是否相互相關，我們可以查看相關性。兩個變量之間的關系可以用統計方式表示，稱為相關系數(或皮爾遜相關)。相關系數值的范圍可以在 -1 和 +1 之間(記為r)，分別是完美的負/正相關，0 表示兩個變量之間沒有相關性和沒有關系。一些示例相關性如圖 2所示。

圖 2：相關系數表示兩組數據如何相互關聯。 A 和 D 顯示完美否定 (A)或正相關 (D)，這在正常實驗中不太可能出現。 B 和 E 顯示出很強的負相關 (B) 或正相關 (E)。C幾乎沒有相關性，數據點聚集在一處，沒有明確的關系，r值接近于0。F 顯示完全不相關(r = 0)，兩個變量之間的關系不是線性的。改編自簡介saylordotorg 的統計數據。

熒光自相關

自相關或序列相關是信號與其自身的延遲副本之間的相關性。換句話說，它是連續時間點上同一變量的兩個值之間的相關性。與標準相關性不同，自相關性只涉及一個變量與其自身進行比較，而不是兩個變量之間進行比較。這允許自相關來表示原始值和稍后時間的值之間的相似程度。

在FCS中，熒光自相關測量不同時間點的熒光強度，如圖3所示。這種自相關函數(ACF)是研究分子時的一個重要變量，因為熒光團擴散系數(激光觀察體積內分子的平均躍遷時間)與ACF 寬度成反比，熒光團濃度與ACF振幅成反比。

圖 3： FCS 中的熒光自相關。左圖顯示了熒光強度隨時間的波動，時間點 (t) 和稍后時間點 (t+τ) 之間可能存在自相關。右圖顯示了時間點 (t) 和稍后時間點 (t+τ) 之間的自相關函數 (ACF)。

使用 FCS 測量的常見標準之一是熒光分子進出觀察體積的擴散速率。一旦熒光分子進入該區域，就可以觀察到熒光強度的波動。通過將熒光波動轉換為ACF，可以提取擴散系數和濃度，如圖4所示。

圖 4： FCS 可用于比較活細胞中不同分子之間的擴散速率和濃度。改編自 Macháň, R. 和 Wohland, T. (2014)。

FCCS 和 FLCS

FCS 有許多子技術，包括熒光互相關光譜 (FCCS)和熒光壽命相關光譜 (FLCS)。

FCCS

熒光互相關光譜 (FCCS)關聯來自兩個不同熒光團的信號，在兩個單獨的通道(例如綠色和紅色熒光)中檢測到。當光譜不同的熒光團附著到兩個分子上時，可以進行雙色 FCCS，顯示兩種類型熒光團之間的相互作用。這對于研究低分子濃度下的結合動力學特別有用。本質上，FCCS可用于以動態方式研究分子結合伴侶以及兩個標記蛋白的共定位，如圖5所示。

為了研究兩個標記分子 A(綠色)和 B(紅色)是否是結合伙伴，可以分析每個分子的 ACF。如果分子 A (ACFg) 和 B (ACFr) 隨時間的熒光強度遵循相同的模式并且它們相關，則這將導致高振幅互相關函數( CCF )(圖 5上圖)。另一方面，如果兩個分子彼此獨立地圍繞定義的體積移動，則這些分子的 不會相關，從而導致低振幅CCF(圖 5下圖)。此外，如果只有一個粒子群具有兩個標簽(綠色和紅色)，則 CCF 的振幅將位于兩個示例情況之間，如圖 5所示.

圖 5： FCCS 是尋找細胞中結合伴侶的有用方法。改編自 Macháň, R. 和 Wohland, T. (2014)。

FLCS

熒光壽命相關光譜 (FLCS)使用脈沖激光，而不是 FCS 和 FCCS 中的連續激光。這允許進行更復雜的分析，FLCS 消除了熒光團之間的背景或光譜串擾。當熒光團無法分離或多個熒光團的熒光壽命不同時，這非常有用。 FCS、FCCS和FLCS之間的相關幅度比較如圖6所示。

圖 6： FCS(黑色)、FCCS(紅色)和 FLCS(藍色/綠色)隨時間變化的相關幅度。消除光散射的效果可以在綠色和藍色跡線之間看到，顯示相關幅度在技術之間的差異。

燃料電池系統應用

FCS 可以與多種顯微鏡技術結合使用，例如共焦、雙光子、受激發射損耗顯微鏡 ( STED ) 和全內反射熒光 ( TIRF )。這些技術涉及將光聚焦在樣品上，并通過使用 FCS 測量熒光強度波動，可以獲得有關熒光團擴散、熒光團濃度和反應速率的附加定量信息。

例如，FCS已被廣泛用于闡明細胞膜中脂質和蛋白質的組織。這種組織水平對于細胞至關重要，因為它們在細胞過程(例如內吞和信號傳導途徑)中發揮著重要作用。通過比較幾種蛋白質的擴散，已經表明一些蛋白質對某些域具有更高的選擇性。另一方面，膽固醇消耗后擴散系數的增加代表相關蛋白質對富含膽固醇的結構域的親和力。 FCS 是研究活細胞分子動力學的強大工具，提供有關細胞內和細胞區室中的分子和擴散的定量答案。

相機

由于 FCS 是一種觀察少量分子的技術，因此相機的視場 (FOV) 并不是重要因素，而 FCS 探測器需要關注速度和靈敏度。 FCS 相機需要高量子效率和優化的像素尺寸，以及高達每秒 1000 幀的速度，才能檢測快速動態結合事件。新的 sCMOS 相機技術可實現單分子事件的高靈敏度和高速成像，使其適用于 FCS。

總結

在 FCS 中，激發光聚焦在定義的體積上，一旦熒光分子通過該體積，熒光強度就會發生波動。因此，可以獲得 ACF 曲線并獲得重要信息，例如分子在質膜中擴散的速度、溶液中某些分子的濃度以及在活細胞中定位結合伴侶。

大約 50 年前，當 FCS 首次引入顯微鏡領域時，由于信噪比較低的缺點，它并沒有引起太多關注。然而，最近在將多種顯微鏡方法與相機開發相結合后，FCS 克服了這一缺點，并轉變為生物化學和生物物理學等多個研究領域的敏感技術。高幀速率和高靈敏度相機(提供更高的信噪比)可以極大地提高 FCS 方法的效率。因此，背照式 sCMOS 相機將有助于以極短的曝光時間進行成像，從而提高采集速度，這對于高速捕獲分子至關重要。極低的噪音性能在這里也很重要。

審核編輯 黃宇