以高通量方式對多種分析物進行無標記檢測是生物傳感應用領域長期追求的目標之一。然而，對于全光學方法而言，如何將最先進的無標記技術與能高通量處理小體積樣品的微流控技術以及能賦予分析特異性的表面化學技術相結合，是迄今為止面臨的一項重大挑戰。

據麥姆斯咨詢報道，近期，來自瑞士蘇黎世聯邦理工學院（ETH Zurich）和美國哈佛大學醫學院附屬麻省總醫院（Massachusetts General Hospital，Harvard Medical School）的研究人員提出了一種無標記光流控（optofluidic）平臺，它將最先進的數字全息技術與基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控技術相結合，并利用支撐性脂質雙層膜（SLB）作為表面化學構件，將這兩種技術融為一體。具體而言，這種光流控平臺通過具有單顆粒靈敏度的多路復用無標記免疫親和檢測方法，實現了對異質生物納米顆粒群的指紋識別。相關研究成果以“Molecular fingerprinting of biological nanoparticles with a label-free optofluidic platform”為題發表在Nature Communications期刊上。

在這項工作中，研究人員圍繞以下三個方面，實現了對異質納米顆粒懸浮液進行無標記分子指紋分析的目標：（1）單顆粒靈敏度的大視場（FOV）成像；（2）高通量、小體積和可單獨尋址的微流控通道；（3）用于拉下免疫親和檢測的片內表面功能化方法。

圖1 無標記光流控平臺的示意圖和工作流程

首先，為了實現大視場（FOV）成像，研究人員使用了反射式內聯全息顯微鏡，由于該研究只對微流控芯片表面和固定在其上的納米顆粒之間的干涉感興趣，因此需要借助空間非相干光源來實現。圖1B展示了光流控平臺的光學讀出策略。作為成像區域，該研究的目標是實現100 μm × 100 μm左右的照明FOV，由于微流控芯片中多個密接界面反射產生的有害寄生條紋的存在，使用高數值孔徑（NA）物鏡的干涉散射（iSCAT）顯微鏡（一種數字內聯全息方法）很難實現這種效果。通過微流控芯片成像時，利用空間非相干照明除了能夠減少這些寄生干擾，還能大大降低斑點的影響。因此，該研究利用窄帶光纖耦合發光二極管（LED）作為光源成像到樣品上。樣品的散射光以及微流控芯片基底界面的微弱反射光被NA物鏡收集，隨后，二者之間的干涉被成像到相機上。為了擴展FOV，研究人員按照既定的計算機視覺程序拼接了一系列光柵掃描圖像。

為了滿足小體積試劑、多路復用和通量的需求，研究人員使用了基于Quake微閥的PDMS基微流控芯片（圖1C）。這種微流控芯片由控制層（橙色）和流動層（淺藍色）組成，可獨立處理不同的傳感通道（黑色箭頭），在不受使用者操作干擾的情況下可以精細控制免疫捕獲檢測的每一步。此外，在該研究提出的微流控芯片的每個微流控通道中可以獨立進行不同的檢測實驗，并通過計算機界面對檢測實驗進行程序化控制，從而為實現免疫檢測的長期自動化提供了可能。此外，就該微流控免疫檢測平臺使用的樣品總體積而言，每個傳感區域的體積大約為10 nL（長、寬、高分別為3 mm、0.3 mm和0.01 mm），加上通道的入口和出口路徑區域，每個微流控通道的體積大約為40 nL。因此，整個微流控芯片使用的樣品量總計不到0.5 μL。

最后，在表面化學方面，為了將建立的微流控技術和成像技術結合在一起，研究人員選擇了SLB（圖1D）作為片內功能化方案的基材，這是因為SLB具有仿生性質，易于制備，且具有內在防污特性和片上兼容性。通過熔融輔助囊泡融合方法制備的SLB可以同時作為防止非特異性結合的鈍化涂層，以及免疫捕獲拉下檢測的構件。

隨后，研究人員對構建的光流控免疫檢測平臺的穩健性和檢測性能進行了表征，并將其應用于通過表面蛋白生物標志物對四種不同的卵巢細胞來源的細胞外囊泡（EV）群進行分析，從而為每種細胞系開發出獨特的生物標志物指紋。

圖2 光流控免疫檢測平臺的重現性和穩健性

圖3 多路復用細胞外囊泡（EV）指紋圖譜

綜上所述，這項研究提出了一種利用微流控芯片上空間相互隔離的微通道對溶液中的生物納米顆粒進行多路復用和分析的方法。該研究提出的微流控芯片可以通過增加獨立通道的數量對其進行擴展以實現更復雜的器件設計。因此，微流控器件的大小和復雜程度將成為多路復用的最終限制因素。不過，作為一種補充途徑，該研究提出的平臺也完全兼容單分子熒光讀出方法，因此可以與最先進的熒光標記抗體或aptamer文庫相結合，實現大規模單顆粒分析。展望未來，將該研究提出的光流控平臺與片上標準加入法和改進的表面鈍化技術相結合，就能根據選定的疾病生物標志物對疾病進行診斷和護理監測。

總之，研究結果表明，該研究提出的光流控平臺整合了必要的檢測步驟，能以無標記的方式對異質生物納米顆粒（例如EV）群體進行分子級別的分析，并具有單顆粒靈敏度、數據統計的穩健性和高度的可重復性。該平臺的光學讀出技術，可以實現對免疫檢測流程的持續原位監測，從而能夠從穩健性、樣品制備時間和所得涂層的高質量等方面優化表面功能化方案。此外，該方法具有通過結合生物標志物群的信息及其對比信息來研究EV潛在異質性的能力。可以預見，在不受顆粒對比度的大小和折射率影響后，這些檢測方法將為在單個EV層面結合分子指紋、大小和有效物質組成信息，從而更好地表征和研究EV的異質性鋪平道路。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41467-024-48132-4

審核編輯：劉清