在顯微成像系統(tǒng)中，常常會用分辨率來評價其成像能力的好壞。這里的分辨率通常是指光學系統(tǒng)的極限分辨率以及成像探測器的圖像分辨率。最終圖像所呈現(xiàn)出的實際分辨率，取決于二者的綜合影響。過高的光學分辨率如果沒有足夠精細的圖像分辨率來體現(xiàn)，則實際分辨率會降低到圖像分辨率以下；如果相機解析能力過高但光學系統(tǒng)的分辨率低，同樣也看不清物體的精細結構。所以在選擇相機的時候，我們也不妨根據(jù)自己這套系統(tǒng)需要達到的分辨率來綜合考慮一下（實操性的結論部分請直接移動到文章最下方）。

1.光學系統(tǒng)的分辨率

光學系統(tǒng)的分辨率，是指"物"在經過光學系統(tǒng)后的"像"在細節(jié)上能被分辨的最小距離。一般我們會用光學系統(tǒng)所能分辨的兩個像點的最小距離來表示，大于這個距離的兩個像點就能被識別為兩個點，而小于這個距離的兩個點經過光系統(tǒng)后就會被識別為一個點。而對于黑白圖樣（熒光樣品其實也是一種黑白圖樣）來說，這個分辨能力也可以用單位距離里內能夠分辨的黑白線對數(shù)來表示，間隔越寬的黑白條紋越容易分別（想象一下細胞的Lamellipodia和Filopodia的差別）。

圖一 從"物"到"像"的失真

存在這個分辨率的原因是因為光學系統(tǒng)的衍射和像差導致從"物"到"像"的過程中會發(fā)生"失真"。這種失真是空間上高頻信號丟失所導致的（光學系統(tǒng)可以看作是一個空間上的低通濾波器，只能允許一定帶寬范圍內的空間頻率信號通過），通俗的理解就是削弱了由"黑"到"白"過渡的銳度和對比度，使其變得平滑和模糊。下圖所示，黑白條紋的真實灰度可以用一個方波信號表示。在經過光學系統(tǒng)之后，如圖像 A 和下方波形所示，原始信號被"平滑"，方波的每一個峰都展寬成一個貝塞爾峰，黑白相交處的信號變化斜率下降到一個固定水平（這個斜率的下降就是以該系統(tǒng)帶寬所做的濾波效果）。當我們將原始條紋變的密集（增加空間頻率），該系統(tǒng)仍以固定帶寬進行濾波，這樣這些被展寬的峰就會互相交疊，損失重疊部分的對比度從而產生圖像B的效果。如果我們換一個帶寬更寬的系統(tǒng) 2，其信號的高頻部分會被更好的保留，表現(xiàn)為黑白交界處的信號變化斜率更大，對比度也越接近真實情況，如圖像 B'。

回歸到我們熟悉的生物熒光成像，上述分辨率的概念通過瑞利判據(jù)與樣品的發(fā)射光波長和光學系統(tǒng)的數(shù)值孔徑相聯(lián)系起來。即在傳統(tǒng)寬場熒光下，光學系統(tǒng)的極限分辨率 d = 0.6λ/NA，波長越短，NA值越大，分辨率越高（可以理解為對空間高頻信號的保留越充分）。

2. 相機的圖像分辨率

說完了光學系統(tǒng)的分辨率之后我們來看看相機的圖像分辨率。圖像分辨率比較好理解，就是單位距離內的像用多少個像素來顯示。以我們的ORCA-Flash4.0為例，芯片的像元大小為 6.5 μm，在 40X物鏡的放大倍率下，1 μm的物經光學系統(tǒng)放大為 40 μm的像，這樣的像會由 40/6.5 = 6.15 個像素來顯示，所以圖像分辨率為 6.15 pixel/μm。反推回實際物體，則圖像中的一個像素點表示的實際距離為 1/6.15 = 162 nm （其實就是像元尺寸/放大倍數(shù)）。根據(jù)這個原理，我們可以得出像元尺寸越小，其圖像分辨率越高。

3. 相機采樣與光學分辨率的匹配關系

那么要使整個系統(tǒng)達到光學上的極限分辨率，我們要如何選擇成像系統(tǒng)使其圖像分辨率相匹配呢？ 這里還需要借助上圖中黑白條紋的例子。圖中不管是圖像 A,B還是 B'，其圖像在x方向上的灰度都可以用圖像下方的波形圖來展示。相機的芯片則會在該方向上以像元尺寸為單位距離均勻對曲線作積分，得到每個像素的數(shù)值。這個過程就是對一個連續(xù)信號的離散采樣。因為芯片上的像素以固定的距離排列，所以這個采樣在空間上的采樣周期 l 對應的就是像元尺寸（更準確的說是兩像素中心點的間距，因為需要考慮芯片的填充因子），其頻率就是單位距離內像素點的個數(shù)。上述黑白條紋圖樣的空間頻率就是白色/黑色條紋重復出現(xiàn)的頻率，而其條紋間距就是他們在空間上的周期 d。頻率越高，這個周期 d 就越短。根據(jù)Nyquist采樣定理（ 詳情請參考網(wǎng)址 ），我們需要以連續(xù)信號最高頻率的2倍作為離散采樣的頻率，才能剛好還原連續(xù)信號的特征。因此我們所需要的芯片采樣周期 l，就應該小于等于條紋間距 d 的一半。同樣類推到相距很近的兩個物點也是如此。如此這樣一來我們就能夠將光學極限分辨率和像元尺寸聯(lián)系在一起了。對于生物成像系統(tǒng)，光學上的極限分辨率就是熒光信號變化的最大頻率所對應的空間周期 d = 0.6λ/NA，因此像元尺寸 l = d × 放大倍數(shù)/2 (注意物點在經過物鏡放大后的像點的距離是d × 放大倍數(shù))。

圖三 "像"的空間頻率和相機的采樣頻率

1. 已有顯微鏡和相機，希望知道當前成像系統(tǒng)的分辨率究竟是多少

我們可以用木桶理論來考慮這個問題。光學系統(tǒng)的分辨率（光學分辨率）和相機的圖像分辨率是整個成像系統(tǒng)分辨率這個"木桶"上的兩塊"木板"；成像系統(tǒng)的分辨率等于這兩塊"木板"上比較差的那個。

對于顯微鏡：

光學分辨率=0.61*λ/NA。

其中λ為波長（對于熒光顯微鏡，就是熒光探針的發(fā)射波長）；NA為物鏡的數(shù)值孔徑（可以在物鏡上找到）。

舉一個具體的例子：一臺熒光顯微鏡，采用NA1.4的63倍油鏡，光路中沒有其他放大；觀察509nm的綠色熒光樣品。

(1) 采用濱松Flash 4.0相機，像元大小為6.5 um。其光學分辨率為：

光學分辨率 = 0.61*509 nm/1.4 = 222 nm

其相機的圖像分辨率為：

相機的圖像分辨率 = 2*6.5 um/63 = 206 nm

比較二者，光學分辨率較差（即數(shù)值較大），所以整個系統(tǒng)的分辨率是受限于光學分辨率的，為222 nm。

(2) 如果采用的是一款11 um的相機。其光學分辨率不變，仍為：

光學分辨率 = 0.61*509 nm/1.4 = 222 nm

但其相機的圖像分辨率為：

相機的圖像分辨率 = 2*6.5 um/63 = 349 nm

比較二者，相機的圖像分辨率較差（即數(shù)值較大），所以整個系統(tǒng)的分辨率是受限于相機像素大小的，為349 nm。

2. 已有顯微鏡，希望知道從成像分辨率的角度如何選擇相機

首先強調，以下建議僅僅是從成像分辨率的角度。在選擇相機時，信噪比常常是更加關鍵的考量。 像 B'。

我們以GFP的發(fā)射波長 λ = 509 nm為例，在使用不同放大倍率的常用顯微鏡物鏡時，其光學極限分辨率和對應的相機芯片像元尺寸匹配如下表：

原則上來說，實際選用的像元大小應小于理想像元大小，像元越小對細節(jié)的解析越好（但是小于理想值的1/2以后就無顯著性改善了）。

但是從圖像信噪比的角度來說，像元越大能夠得到更高的信噪比。不同相機除了在像元大小上有所差別，在靈敏度、噪音等方面也是不盡相同。所以在選擇成像系統(tǒng)時要充分考慮實際情況來進行多種條件的平衡與取舍。

審核編輯：湯梓紅