引言

由于尺寸大，成本高和擴增時間長，傳統的 PCR 熱循環儀僅限于主要醫院和實驗室。

最近，通過簡化設備結構并減少擴增時間，開發了新平臺。一種解決方案是利用溫度梯度誘導產生自然對流，從而提升 DNA 的擴增。

當試劑由于自然對流效應而在溫度區域之間反復循環時，試劑將在一次循環中經歷 PCR 循環的三個步驟 (即核酸變性，退火和延伸)。因此，對流 PCR 可以將擴增時間從數小時縮短到 30-40 分鐘。

通過使用這種機制，不需要專用的熱循環儀。實時對流 PCR 設備也可以結合熒光檢測器來設計。

然而，當前的對流 PCR 系統采用兩個或更多個獨立的溫度控制器，且需要設計特定形狀的管子或腔，以使樣品液徹底流通。此外，某些操作需要特定的技巧，如從細管中裝載和卸載試劑以及密封管的兩端而不將氣泡困在里面。每一步操作對 PCR 成功擴增都至關重要。

儀器設計

圖 1 所示為儀器示意圖，該儀器由光源，測量熒光強度的光學系統，用于維持 95℃ 恒定溫度的可控熱系統組成。采用藍色 LED 提供 450-520nm 的寬帶光作為 DNA 量化實驗的光源。

采用 CCD 相機通過 530 nm 光學濾光片來測量 PCR 混合物反射的熒光強度的寬光譜響應。

該機器包含一個半導體制冷器 (thermoelectric cooler) 和一個風扇，分別用于升高和降低外殼溫度。將半導體制冷器放置在 銅支架基板和海綿之間以形成加熱器件。將熱電偶插入半導體制冷器中來確定銅支架基板的溫度，以保持 95℃ 的恒定溫度。

圖 1 儀器圖解視圖

樣品容器采用底部封閉的商用玻璃毛細管( 100ul )。毛細管長 32mm，內徑和外徑分別為 2.3mm 和 3.2mm。

毛細管在 95°C 的固定溫度下從底部加熱，在試管內形成溫度梯度并產生自然對流，從而引起試劑在毛細管中自發循環，從而完成 DNA 的擴增過程(變性，退火和延伸)。

該項研究采用了乙型肝炎病毒 (HBV) 作為模板?DNA 進行擴增。將 122 bp 的HBV DNA 模板與毛細管中制備的引物相混合。

表 1 列舉了所用到的試劑。本文采取高-內徑比為 7.7，體積為 75 μL 的毛細管來進行 DNA 擴增。

計算分析

當在毛細管下方加熱流體時，底層中的流體顆粒比頂層中的流體顆粒更溫暖和更輕。因此，流體的流動有上升的趨勢，而粘性力 (viscous forces) 的作用會減慢顆粒的向上運動。這個過程被稱為瑞利-貝納德 (Rayleigh-Bénard) 不穩定性，導致對流運動的產生。

鑒于該過程涉及到的浮力和粘性力，不穩定性受 瑞利數(Ra) 控制，其定義如下：

其中，

?? :?重力加速度

??：流體熱膨脹系數?

??,???: 腔室內?流體頂部(冷)和底部的溫度(熱)

??: 流體的高度

??:?熱擴散率

??:?運動粘度 (kinematic viscosity)

當瑞利數超過臨界值時，便會發生對流現象 (不穩定的浮力引起流體在腔室上下表面循環運動)。Ra 是影響對流腔室內流體流動性能 (stream function)，速度和溫度分布的關鍵參數。影響熱流體流動的另一個參數是 ??。其中，??是腔內徑。

因為，PCR 擴增效率受試劑和溫差影響，因此，只能通過更改腔體高度來更改Ra，而將幾何形狀作為流量控制的主要參數。

對于 PCR 熱循環，因反應在水溶液 (aqueous solution) 中進行，因此其流體性質是恒定的(??、??)。

結果和討論

圖 3 所示，(a) 由瑞利-貝納德對流控制的模擬溫度場。為觀察內部流動結構，在去離子水中注入直徑為 50um 的聚苯乙烯顆粒 (密度 ??)可視化的顆粒路徑如 3b 所示。?(c) 預測時間和速度輪廓。視頻見下 1 。

圖 3

在毛細管中，流體的滾動運動使得樣品經歷退火和延伸，DNA 模板從管頂部掉落并再次加熱實現 PCR 循環。模擬和實驗結果均表明，單個 PCR 周期大約需要 30 s 。因為完成一個 PCR 流程需要 55-60 個循環，所以預計完成整個 DNA 擴增的總反應時間約為 28min 。

本文采用目標 DNA 片段 (HBV 122 bp) 進行 DNA 定量測量，目標 DNA 的初始拷貝數范圍為??拷貝/ uL 至 ??拷貝/ uL。

?

?