在剛剛過去的蘇州標記免疫分析專業委員會2019學術峰會上，浙江清華長三角研究院分析測試中心蔡強主任詳細講述了分子診斷IVD設備的發展史。

蔡強：研究員、浙江清華長三角研究院分析測試中心主任、國家食品安全風險評估中心應用技術合作中心副主任

分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷在臨床診斷中的技術主要包括PCR技術、芯片技術和測序技術。臨床檢測中，分子診斷越來越受到重視，但市場占比與生化診斷、免疫診斷相比，還存在一定的差距。

目前分子診斷在體外診斷中的主要的應用領域，包括對病毒、細菌等微生物的篩查及定性定量檢測，藥物篩選及用藥分析以及基因早期的分析。在微生物檢驗檢測方面，分子診斷相對于免疫診斷具有一定的優勢；基因圖譜分析方面，雖然目前相關研究很多，但在該領域應用的臨床價值還有待發掘。

分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷和微生物診斷存在一定的關聯性，微生物診斷是外部特性分析，而分子診斷則是對內部分子的檢測。

表1 分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷主要技術發展的時間軸

早期的分子診斷設備，多為大型集成化設備，包含很多的操作模塊。在原理上，早期的設備并無很多創新，主要是將多種手工操作內容自動化和集成化，發展到基因芯片，才有了原理性的突破。1990年提出的人類基因組計劃、后來的蛋白組學以及從近期開始的微生物組計劃，極大的推動了分子診斷設備的發展。產品方面，較早期時有Affymetrix公司推出的第一塊商業化基因芯片。

接下來是PCR儀器的發展。早期的PCR儀器，是簡單的DNA解鏈、復制、復性等過程，除了水浴鍋自動化，并沒有太多技術含量。數字PCR技術出現后， 與生物信息學和微型加工技術關聯起來，發展速度很快。再后來出現了微流控技術和基因測序技術。基因測序技術經歷了一代、二代、三代，目前測序技術，仍然是重要的發展方向。

分子診斷主要技術發展的時間軸

前處理復雜導致分子診斷的現場應用成為瓶頸

分子診斷和免疫診斷、生化診斷設備不同的地方，很大程度在于樣品前處理。免疫檢測對象主要是一些游離的大分子，處理相對容易，但分子診斷樣本處在細胞當中，處理過程容易被污染，因此前處理系統相對復雜。

分子診斷系統的組成包括樣本前處理系統、檢測處理系統和分析處理系統。樣本前處理系統依據其功能的豐富程度又包括移液操作和核酸提取兩個平臺，依據使用場所不同分為實驗室自動化平臺和現場前處理平臺。

目前前處理設備中，全自動的移液工作站是比較成功的設備。它是一種全自動、高精度移液系統，專門用于小體積的PCR、qPCR體系配置，能夠完全替代手工，保證了配置實驗擴增體系的正確性、精密度及重復性。缺點是功能單一，臨床及科研應用尚有一定局限性。

貝克曼自動化工作站Biomek i7

核酸提取設備，主要是自動核酸提取儀，該儀器集成了自動移液工作站和標準耗材，在以其預設程序控制下進行核算分離的儀器，這一類自動化系統在科研和臨床中應用最為廣泛。提取方法的核心是免疫磁珠，包括磁珠吸附和磁珠分離等。除磁珠提取純化方法外，還有其他純化方法，如柱層析法。

托摩根核酸提取儀 MM96

目前，現場分子診斷還存在諸多問題。免疫檢測中可用試紙條等材料，檢測方便，但是分子診斷沒有這類材料可用，主要原因是樣品前處理無法達到這種檢測目的。當現場檢測時，在很開放的環境下，如何提取純化DNA，目前仍沒有簡易方法。現場檢測的需求，目前在醫院的臨檢中心還不大，對于基層的衛生所，或許會存在這樣的需求，從這個問題也引發出醫療模式應該往什么方向發展的思考。

分子診斷的三大檢測平臺

分子診斷主要的檢測平臺為PCR儀、芯片系統以及基因測序平臺。

PCR儀——數字PCR是未來發展趨勢

分子診斷設備另一個重要的組成內容是PCR儀器。常規的PCR目前技術上可提升的空間很有限，但很多部件只有少數幾家廠家做的不錯。

熒光定量PCR，國內有很多廠家生產，技術、元器件等各方面正在迅速趕超國外儀器廠商水平，但這未必是國內廠商最終的發展方向。得益于光源及檢測器件小型化趨勢，現在的熒光PCR儀越來越小型化。

數字PCR是PCR領域未來發展的趨勢，目前有一些廠商在研究生產，比如銳訊生物、新羿生物、領航基因等。現在數字PCR的售價很高，主要原因是后端檢測器件靈敏度要求高，成像器件技術先進，造成成本偏高。當然，因為數字PCR有絕對定量的功能，對于分子檢測意義重

微滴式數字PCR的檢測流程

表2 3種PCR的比較

DNA微陣列——基因芯片

熒光原位雜交（FISH），是一種傳統方法，對于原位切片的分析有一定的意義。儀器本身比較簡單，就是熒光顯微鏡，外加一個殼構成的一個圖像分析儀。檢測過程是在一定的溫度下將切片加入設備中，成像。雜交的另一種方式是利用芯片進行，主要是DNA微陣列芯片。芯片技術從上世紀90初期開始研究到現在，已經有近三十年時間，目前已經應用到診斷當中，用做疾病篩查。熒光原位雜交最核心的地方在于診斷試劑而非設備。目前的檢測方式主要采用熒光標記的方式，在靈敏度方面，已經能夠滿足檢測要求，因此化學發光、電化學發光標記方式相對較少。

美谷分子GenePix 4300A&4400A微陣列基因芯片掃描儀

第四代基因測序成為資本追逐熱點

基因測序的發展，從最早獲得諾貝爾獎的一代，到現在已經發展到第四代。原理上，第一代測序儀可認為是人工操作方法的儀器實現，相對比較簡單。現在的第三代測序和第四代測序的原理已有一定區別。目前，高通量測序的需求很大，發展很迅速，國內在基因測序儀器的發展也將會越來越快。第三代和四代測序儀的價值在于直接讀取功能大，但成本很高，測序時間長。把測序降到10美元以下是全球相關企業追求的目標，如果實現，測序在診斷中的應用將會更多的取代其他技術。

四代測序，即納米孔技術測序，目前已經成為資本市場追逐的熱點，容量約為幾十億美元。原理很簡單，就是DNA鏈打開后穿過一個很細的孔，單個堿基對通過納米尺寸的通道時，會引起通道點穴性能的變化。四代測序具有高讀長、易集成、小型化、高速度、大通量等優勢。納米孔所通電流很小，為10-18-10-15A，遠低于熒光檢測電流，所以目前檢測時間大約需要幾個小時到十幾個小時，隨著技術的不斷進步，后期有望將測序時間縮短到半小時。

納米孔主要包括兩大類生物納米孔和固態納米孔。生物大分子納米孔發展較早，已經有了相應的設備，體積很小，準確率較低。固態納米孔，目前還是實驗室水平，有少數四代測序公司已經開始做固態納米孔測序儀。固態納米孔的檢測方式很多，在基底上做一些材料摻雜，具有半導體特性，可替代光學器件，精確度也等性能指標更好。因為固態納米孔使用的是標準的微電子工藝，如果可以規模化生產，可以降低測序儀生產成本，值得推廣。

測序結束后，數據處理比其他診斷方法更為復雜。免疫檢測的IVD設備后期用到的主要是數據庫管理，無需數據處理，但是分子診斷數據需要用算法進行處理，這些算法也就是生物信息學的發展源頭。目前來講，做算法的人才和做軟件的人才都并不缺乏，缺乏的是能夠將算法做成軟件的人才，這是基本事實。目前很多高校已經發表了很多算法相關的論文，但是軟件依舊很少。目前很多檢測機構所用的數據分析軟件多是英文軟件，很多還是開源軟件，這種軟件不適合醫院檢驗使用。因此，數據處理軟件不足，對測序設備在臨床的應用是個非常棘手的問題。

除了上述測序技術，DNA條形碼與測序結合起來，未來在臨床上或可發揮一定的作用。DNA條形碼是利用標準的、有足夠變異的、易擴增、較短的DNA片段在物種內的的特異性和種間的多樣性而創建的一種新的生物身份識別系統。目前主要用于物種鑒定。