文章來源：老千和他的朋友們

原文作者：孫千

本文主要講述掃描電鏡圖像分辨率評估新方法(SIRAF)。

SEM是一種功能強大的工具，在材料科學、生物學、納米技術和醫學研究等科學領域得到廣泛應用，其常見用途是測量納米和微米尺度上物體或結構的尺寸。

大多數圖像可視為理想圖像（It(x,y)）通過與核函數的卷積而產生模糊效果。這個核函數被稱為圖像點擴散函數（PSF(x,y)）。對于SEM，PSF主要由電子束的形狀和空間密度決定，通常遵循艾里斑模式。艾里斑的數學表達式可用高斯函數近似，這適用于聚焦和近聚焦圖像。

PSF的寬度可作為分辨率的度量標準，因為它對應于成像信號的脈沖響應。因此，PSF寬度反映了圖像中最小可分辨對象的大小，并影響尺寸測量的不確定性。描述PSF寬度的常用參數是高斯半高全寬（FWHM）。除PSF外，SEM圖像形成過程中還存在噪聲影響（N(x,y)），主要由源和樣品電子發射的隨機性引起。因此，整體圖像形成過程可描述為：

ISEM(x, y) = It(x, y)?PSF(x, y) + N(x, y)

其中ISEM(x,y)為獲取的SEM圖像，?為卷積算子，x和y為圖像坐標。

理想的點擴散函數（Point Spread Function, PSF）應當具有兩個像素的最大空間周期，使得如階躍函數般銳利的強度躍遷能夠完全分辨，這一標準被稱為奈奎斯特采樣。然而，在實際成像過程中，即使在最優設置條件下，PSF往往對獲取的圖像產生不可避免的模糊效應，這種現象在高倍率成像中表現得尤為明顯。

當束斑直徑超過單個像素的尺寸時，相鄰像素的信息會發生混合，從而導致圖像的實際分辨率降低。這種現象被稱為過采樣和空放大，它直接影響了成像系統的分辨能力。因此，在任何成像系統中獲取高分辨率圖像時，PSF的優化都是一個關鍵的技術過程。

對于SEM而言，PSF主要受電子束的尺寸和形狀影響。這些參數不僅取決于用戶的操作技能，還與電鏡的各項設置和校準狀態密切相關，如焦點調節、像散校正、光闌選擇、束斑尺寸、探針輪廓、電壓設置、掃描速率和束流等參數。更為復雜的是，樣品本身也會通過二次電子產額、發射區域大小、表面形貌、位置漂移和充電程度等因素對PSF產生顯著影響。

這些多重因素的綜合作用增加了PSF評估的復雜性，使得PSF可能因用戶、儀器和圖像的不同而產生變化，甚至在同一圖像的不同局部區域也會因樣品的高度、厚度、成分和形貌差異而呈現出不同的特征。

目前尚無簡單且成熟的方法來評估SEM圖像的實際分辨率，盡管已提出多種方法。這些方法包括間隙法、對比度-梯度法以及基于快速傅里葉變換（FFT）分析的方法。

間隙法作為最早的技術之一，其原理是依靠用戶識別獲取圖像中兩個物體之間最小可辨別的間隙，并將其作為圖像分辨率的度量標準。然而，這種方法高度依賴于樣品特性和用戶的主觀判斷，主要適用于標準樣品，如碳基底上的金或錫顆粒等特定樣品類型，其應用范圍相對有限。

相比之下，對比度-梯度法是一種全自動技術。它將圖像分辨率定義為從5×5像素子集中局部梯度和對比度躍遷確定的局部分辨率的加權調和平均值。該方法已被證明優于間隙法，但在處理高分辨率和噪聲圖像方面存在困難。

基于FFT分析的方法首先將圖像分解為具有不同波長的加權正弦函數，然后利用幅度譜或功率譜進行分辨率和像散測量。在這類方法中，SMART程序是一個較為典型的應用，它要求用戶輸入閾值來區分功率譜中的信號和噪聲，從而使程序能夠將橢圓擬合到圖像的二值化FFT，并利用其長軸和短軸來估算圖像分辨率和像散。然而，由于該方法依賴用戶區分信號和噪聲的主觀判斷能力，可能存在系統性偏差。

Mizutani等人在2016年提出了另一種FFT方法，通過計算功率譜的徑向平均值，并將直線擬合到所得曲線的陡峭部分，基于擬合線的斜率估算高斯PSF的半高全寬。但是，該方法涉及用直線近似非線性數據集，這種處理方式可能存在理論上的問題。

互相關方法作為另一種基于FFT的技術，通過將像素子集的FFT復共軛與來自同一圖像的位移像素子集的FFT相乘，然后進行逆FFT處理來估算分辨率。盡管該方法具有較高的精度，但需要調整可調參數以獲得最大的精度和準確性，且僅限于沒有高對比度特征的均勻樣品。

為了解決現有方法的局限性，Anders Brostrom等人提出了基于傅里葉分析的空間圖像分辨率評估（SIRAF）算法。該算法采用FFT分析技術，能夠估算圖像中尺寸測量伴隨的不確定性，直接從單個圖像提供分辨率測量結果，無需額外的用戶輸入，但為用戶提供了修改和檢查結果的選項。

SIRAF算法的核心創新在于，它不是簡單地擬合直線，而是將理論推導的函數擬合到幅度譜的徑向平均值。這種方法基于兩個關鍵假設：首先，PSF可用高斯函數進行合理近似；其次，樣品圖像中的邊緣是銳利的，可用階躍函數進行描述。這些假設對于包含均勻背景上高對比度結構的樣品是合理的，例如沉積在碳基底上的顆粒或液體中顆粒的原位STEM圖像。

SIRAF算法經過了系統性的驗證測試。首先，該算法在一系列模擬圖像上進行了測試，這些模擬圖像使用基于Cizmar等人2008年工作的定制Python代碼生成。模擬圖像涵蓋了廣泛的參數設置，在焦點、像散、噪聲、強度差異、振動效應以及顆粒大小、對比度和邊緣效應方面都存在變化，這使得研究人員能夠系統地識別算法的潛在陷阱和不足之處。

此外，該算法還在來自碳上金樣品的一系列SEM圖像上進行了實際測試，這些圖像在多種不同倍率下作為焦點系列獲取。最終，該方法在包括二次電子和背散射SEM、SEM中的STEM、高角環形暗場STEM、明場TEM以及明場和暗場光學圖像在內的多種成像模式上進行了綜合演示。

研究結果表明，SIRAF算法在所有測試情況下都給出了合理和可靠的結果，證明了該方法對多種成像模式具有良好的穩健性和通用性。對于計量學應用而言，能夠針對具體情況估算圖像分辨率，以考慮尺寸測量的不確定性并評估最小可分辨物體，具有重要的實際意義。

實驗方法

在許多SEM圖像中，小物體的強度輪廓通常呈現為平滑的峰，相當于高斯模糊的點源。相比之下，較大物體顯示更銳利的變化，在其中心有一個平臺區域，類似于兩個符號相反的高斯模糊階躍函數——一個向上，另一個向下。基于這些觀察，假設SEM圖像中的物體可用與高斯函數卷積的階躍函數來近似。由于符號變化不影響頻率空間中的函數，考慮一個階躍函數就足夠了。

階躍函數：h(x) = 1/2 (1 + sgn(x))(1)

高斯函數：g(x) = βe^(-x2/(2σ2))(2)

其中，x為空間坐標，β為幅度縮放參數，σ為高斯PSF的標準偏差。感興趣的參數是σ，因為它與背景和物體之間過渡邊緣的清晰度相關。在本研究中，FWHM被用作分辨率度量，約為2.355σ。

為獲得整個圖像的平均FWHM，分析在頻率空間中進行，因此需要兩個函數的傅里葉變換（FT）：

階躍函數的傅里葉變換：FFT[h(x)] = H(k) = 1/2 δ(k) - i/(πk)(3)

高斯函數的傅里葉變換：FFT[g(x)] = G(k) = β√(2π)σe^(-2(πσk)2)(4)

其中k為頻率，H(k)和G(k)分別為h(x)和g(x)的FT。DC分量（k = 0）與此分析無關，因為分辨率信息位于k ≠ 0分量中，因此可以忽略H(k)中的delta函數。

根據卷積定理，得到：

G(k)*H(k) = -iσβ√(2π)/k e^(-2(πσk)2)(5)

獲取G(k)*H(k)的絕對值以得到幅度譜。這樣做會丟棄相位貢獻并消除復數值(i)。在函數可用于擬合之前，添加值1并取自然對數。這樣壓縮了幅度譜中覆蓋的動態范圍并確保正值，使后續擬合程序更加穩健。因此，用于擬合的函數由以下方程給出：

c + ln(1 + |G(k)*H(k)|) = c + ln(1 + σβ√(2π)/k e^(-2(πσk)2)) (6)

其中c為擬合過程中使用的任意縮放參數。

圖1. (a–d) SIRAF算法的步驟，下文將詳細描述。(a)原始圖像，(b)應用漢寧（Hanning）過濾器后的圖像，(c)漢寧過濾圖像的振幅譜，(d)在振幅譜上標記的距離區間示例，(e)各距離區間的平均振幅與其半徑的關系圖。圖中藍色繪制的是從圖像本身獲得的數值，而紅色虛線繪制的是用方程(6)中表達式擬合得到的結果。

FFT處理的核心步驟

SIRAF算法的核心在于對目標圖像進行一系列精心設計的FFT處理步驟。首先，算法采用漢寧窗（Hanning window）對原始圖像進行預處理。這一步驟的重要性在于消除圖像邊界處的不連續性問題。在FFT分析中，由于循環邊界條件的存在，圖像邊界的不連續性會在幅度譜中產生明顯的垂直和水平亮線，即所謂的吉布斯效應（Gibbs effect）。漢寧窗的應用通過對圖像中心區域賦予更高權重，而對靠近邊界的區域逐漸降權至零，有效緩解了這一問題。

在幅度譜分析階段，算法對位移FFT圖像的絕對值進行重新縮放處理。具體而言，通過在獲取自然對數之前將所有數值加1，確保了數據的數值穩定性。隨后，基于像素到圖像中心的歐幾里得距離，將像素分配到不同的距離區間中。

這種分區策略的精妙之處在于，通過將像素坐標標準化至圖像尺寸，使得圖像中心的距離為0，角落像素的距離約為0.707，形成了FFT的歸一化正弦頻率表示。

徑向平均與擬合分析

算法的核心創新在于將二維頻域信息壓縮為一維徑向平均函數。通過確定每個距離區間的平均幅度，并將其繪制為距圖像中心距離的函數，算法實現了圖像信息的有效降維。這種徑向平均方法不僅簡化了數據處理復雜度，更為后續的數學擬合提供了理想的數據結構。

在擬合過程中，算法采用了改進的策略來處理漢寧窗引入的低頻成分影響。由于漢寧窗會在圖像中添加低頻成分，可能影響接近零頻率處徑向分區幅度譜的斜率，算法提供了排除低頻和高于0.5頻率成分的選項，從而在特定情況下改善擬合效果并提供更可靠的FWHM（半峰全寬）估計。

算法實現與性能評估

SIRAF算法采用Python 3.7開發，充分利用了OpenCV、NumPy和SciPy等成熟庫的功能。算法的輸入簡潔明了，僅需單個圖像文件，輸出包括以像素為單位的σ和FWHM值，以及基于擬合參數協方差估計的標準偏差誤差。在性能方面，算法表現出色，對800×800像素的SEM圖像處理時間僅約0.42秒，顯示了良好的計算效率。

為驗證算法的有效性，研究者采用了多層次的驗證策略。首先通過具有已知參數的模擬圖像驗證算法的準確性，隨后在真實SEM圖像上進行測試。實驗涵蓋了多種放大倍率（5k至100k倍）和相應的像素分辨率（57.8至2.9 nm/像素），確保了算法在不同成像條件下的適用性。

應用范圍與實用價值

SIRAF算法的應用范圍極為廣泛，涵蓋了現代科學成像的主要技術類型。算法在SEM中的STEM模式、二次電子和背散射電子成像、HAADF-STEM、TEM以及明暗場光學成像等多種成像方式上均表現出良好的適應性。測試樣品包括銀和金納米顆粒、聚苯乙烯乳膠珠、NaCl晶體、碳納米管等多種材料體系，充分驗證了算法的通用性和魯棒性。

實驗結果與討論

實驗設計與圖像模擬

為了全面評估SIRAF算法的性能，研究采用了50張具有不同焦距的模擬圖像進行初步測試。這些圖像采用標準設置進行模擬，生成的圖像類似于碳基底上的金顆粒結構，并以掃描電鏡（SEM）圖像的形式呈現明亮邊緣特征。值得注意的是，該測試將算法應用范圍擴展到假設模糊階躍函數的情況，這在一定程度上超出了算法的原始設計范圍。

在圖像模擬過程中，代碼設置基于用戶指定限制范圍內的隨機值生成圖像。這種設計確保了測試圖像的多樣性，同時保持了實驗的科學性。雖然顆粒位置等參數會發生變化，但整體尺寸分布和強度分布在不同圖像間保持一致，從而避免了對算法結果的干擾。

不同模糊程度下的圖像特征分析

實驗中，50張圖像使用標準設置生成，通過改變高斯PSF的寬度來模擬不同的聚焦狀態。寬度參數在50個步長中從半高全寬（FWHM）的0像素變化到23.55像素，對應的sigma值從0像素到10像素，步長為0.2像素。

通過對三種典型情況的分析，可以清晰地觀察到模糊程度對圖像質量的影響。當FWHM為1.41像素時，圖像呈現出非常清晰的SEM圖像特征，所有物體的內部結構均清晰可見，最小物體完全分辨，邊緣呈現近似階躍狀特征。當FWHM增加到4.71像素時，圖像對應輕微失焦狀態，邊緣銳利度下降，較小物體在某些情況下會與其他物體模糊在一起。而當FWHM達到23.55像素時，圖像呈現高度失焦狀態，較小物體不再可辨，較大特征模糊融合，幾乎形成單一結構。

圖2. (a–c)模擬的"標準設置"圖像，分別經過半峰全寬為1.41、4.71和23.55像素的高斯點擴散函數模糊處理。所有圖像均為800×800像素。(d)圖像(a–c)中每個距離區間的歸一化頻率與平均幅度的關系圖，以及SIRAF算法獲得的擬合結果。(e)所有50張模擬圖像的高斯點擴散函數已知半峰全寬與擬合值的對比。誤差線對應于從擬合協方差矩陣確定的估計標準偏差。圖中同時顯示了SMART算法的結果，其誤差線對應于同一用戶連續三次運行結果的標準偏差。

頻域分析與算法擬合性能

通過徑向平均幅度譜分析，研究進一步驗證了不同模糊程度圖像的頻域特征。聚焦圖像由于包含豐富的細節信息，在高頻和低頻快速傅里葉變換（FFT）分量中均攜帶重要信息，導致頻譜曲線呈現傾斜特征。相比之下，模糊圖像細節較少，其FFT主要由低頻分量的陡峭上升所控制。研究表明，方程(6)中的表達式能夠為所有三種模糊情況產生合理的擬合結果，證明該表達式可以有效捕獲清晰和模糊圖像中的強度變化特征。

SIRAF算法性能驗證

通過將50張模擬圖像的實際PSF FWHM與擬合值進行對比分析，研究全面評估了SIRAF算法的準確性。實驗結果表明，SIRAF算法在大約1到20像素的范圍內能夠將實際FWHM估計控制在半個像素的誤差范圍內，顯示出良好的精度表現。當FWHM大于20像素時，雖然算法誤差超過0.5像素，但相對誤差仍然保持在較低水平（小于5%）。

然而，當接近像素分辨率（FWHM小于1像素）時，SIRAF算法的誤差增加到最大1.5像素。這一現象在基于FFT分析的分辨率方法中較為常見，主要原因是具有像素分辨率的圖像在其幅度譜的所有空間頻率中都包含信息，使得從信號到噪聲的轉換檢測變得困難。

算法比較與應用前景

與SMART算法的對比分析顯示，兩種算法產生了非常相似的結果。然而，SIRAF算法具有自動化程度高的優勢，而SMART算法需要用戶對每張圖像進行手動操作，且存在用戶間變異的問題。

SIRAF算法性能評估研究

為進一步驗證SIRAF算法的魯棒性，對其在廣泛參數設置下的模擬圖像中進行了深入測試。測試參數涵蓋泊松噪聲程度、像散效應、振動影響（包括振動像素偏移的數量和幅度）、邊緣效應的強度和寬度、顆粒間強度差異，以及顆粒數量、尺寸和內部圖案等因素。所有圖像均采用"標準設置"生成，每次僅變更單一參數和圖像模糊程度。

噪聲水平和像散的影響

分析結果表明，大多數參數對SIRAF算法的性能影響甚微，僅像散和噪聲水平對結果產生顯著影響。噪聲通過計算圖像的泊松噪聲并與原始圖像混合的方式引入，用戶可通過調節噪聲圖像相對于原始圖像的權重比來控制噪聲水平。需要注意的是，噪聲水平為10時已遠超簡單泊松噪聲范疇，更接近椒鹽噪聲特征。

圖3展示了噪聲對算法的影響以及不同噪聲設置下的三張模擬圖像。在無噪聲（0.0）情況下，歸一化頻率0.5處觀察到的信號下降源于微弱的吉布斯效應。

圖3. (a–c)三幅分析圖像，FWHM為2.36像素，噪聲水平從左到右遞增。所有圖像均為800×800像素。(d)噪聲設置為0、0.4、2和10，FWHM為2.36像素的圖像的歸一化頻率與各距離區間的平均幅值的關系圖，以及使用SIRAF獲得的擬合結果。(e)高斯PSF擬合FWHM與實際FWHM之間的誤差與實際FWHM的關系圖，對應圖(d)中的四次擬合結果。

當FWHM低于10像素時，噪聲對算法結果產生明顯影響。在此條件下，盡管實際FWHM為2.355像素，擬合結果可高達5.4像素。然而，實際圖像很少出現如噪聲水平為10.0的模擬圖像般的低質量情況，該設置下引入的噪聲已類似椒鹽噪聲。在更為現實的噪聲水平范圍（0-2之間）下，算法能夠產生合理的結果。

結果顯示，算法在處理像散圖像時存在困難，這類圖像在x和y方向上的模糊程度不等。因此，幅度譜中的圓形結構會扭曲為橢球體，并可能根據像散方向發生旋轉。SIRAF的當前版本未考慮這種扭曲效應，因此在使用SIRAF評估圖像分辨率時，確保像散程度可忽略至關重要。

SIRAF算法的另一個局限性在于處理具有重復圖案（如晶格條紋）的圖像。這類圖案會在幅度譜中產生明確的亮點，干擾徑向分組過程。雖然可通過簡單遮罩移除大部分亮點，但仍可能對分辨率估計精度產生輕微影響。作為替代方案，SIRAF提供手動擬合選項，允許用戶手動調整擬合參數，以應對FFT中的衍射點等特殊情況。

真實的SEM圖像評估

為測試自動聚焦應用，在Au/C樣品同一位置采集了不同焦點的SE圖像系列，失焦程度用相對工作距離（WD）表示。圖4顯示了三張不同焦點設置的圖像及相應擬合結果。

圖4. (a–c)在不同聚焦設置下獲得的沉積在TEM載網上的金顆粒的SEM圖像。最清晰的圖像顯示在(a)中，從左到右離焦程度逐漸增加。(d)振幅相對于歸一化頻率的曲線圖，以及SIRAF的擬合結果。(e)每個獲得的SEM圖像的SMART算法(紅色)和SIRAF算法(藍色)擬合的半高全寬(FWHM)相對于離焦的曲線圖，離焦用相對于焦點的工作距離表示。SMART算法的誤差棒為同一用戶連續三次運行的標準偏差。

圖4a為最清晰圖像，可分辨幾十納米的小顆粒；隨失焦程度增加（WD下降36μm），圖4b中小顆粒不再可見，圖4c中連100nm的大顆粒也無法分辨。實際數據擬合效果不如合成數據，主要因為擬合表達式過于簡單，且假設模糊僅由高斯PSF引起。對于高度失焦圖像，艾里斑圖案顯示菲涅耳環，高斯函數無法解釋。盡管如此，所有圖像都產生了合理擬合（r2值0.95-0.98）。

圖4e顯示FWHM與WD呈V形關系，最清晰圖像位于最小值處，適用于自動聚焦。SIRAF與SMART算法結果高度一致，差異通常小于單個像素，但SIRAF無需用戶輸入。

算法還在5k-100k倍率下測試（像素分辨率57.8-2.9 nm/像素）。結果顯示所有焦點序列均呈V形，隨倍率增加V形變窄。關鍵發現是以nm為單位的FWHM在倍率超過25k時不再改善，表明出現空放大，算法可用于確定最佳倍率。

圖5.左圖：使用SIRAF獲得的以像素為單位的擬合FWHM值，針對在5k、10k、25k、50k和100k放大倍數下進行的五個不同焦點序列，與相對工作距離的關系圖。右圖：與左圖相同的數據，但通過乘以像素分辨率將像素單位轉換為納米單位。

最后在多種顯微鏡技術（SE/BSE、STEM、HAADF-STEM、明場TEM、光學顯微鏡）上測試了算法通用性。測試樣品包括NaCl晶體、纖維、乳膠珠、納米管等沉積在不同基底上的顆粒。所有情況下均產生高質量擬合，僅在具有晶格條紋的TEM圖像上失效，但這類圖像易識別且可通過遮罩或手動擬合處理。

結論

本文提出了基于FFT的SIRAF算法，通過將理論函數擬合到徑向平均FFT幅度譜來評估圖像空間分辨率。該算法基于強度躍遷可用被高斯PSF模糊的階躍函數描述這一假設，在碳基底金納米球的合成和真實SEM圖像上得到驗證。

測試表明算法在大多數條件下能提供準確的FWHM估計，但在極端噪聲、像散和重復模式下性能會下降。該算法可用于自動聚焦和放大倍數優化，并在多種顯微技術（包括SEM、STEM、TEM和光學顯微鏡）中表現出高質量擬合效果。

總體而言，SIRAF算法具有通用性強、全自動、無用戶偏差等特點，為電鏡圖像分辨率評估提供了重要工具。