從實(shí)驗(yàn)室到生產(chǎn)線

固態(tài)光源技術(shù)在生物成像與工業(yè)檢測(cè)中的性能提升

生物醫(yī)學(xué)成像和工業(yè)檢測(cè)的照明系統(tǒng)規(guī)格通常集中在光譜、空間和時(shí)間的光輸出特性上。Lumencor的技術(shù)支持總監(jiān)Iain Johnson和我們分享了固態(tài)光源陣列——LED、發(fā)光管和激光器組合成的固態(tài)光引擎如何實(shí)現(xiàn)規(guī)格定制，以滿足特定應(yīng)用的照明要求。

固態(tài)光引擎是一個(gè)集中控制的固態(tài)光源陣列，其輸出合并到一個(gè)共同的光學(xué)傳輸系統(tǒng)中（圖1）。光源的輸出可以并行激活以產(chǎn)生白光（圖2），或在需要分離的波長(zhǎng)時(shí)，也可按順序進(jìn)行激活（圖3、圖4）。光源本身可以采用一種固態(tài)照明技術(shù)，即LED、光導(dǎo)管或半導(dǎo)體激光器，也可以對(duì)這些光源技術(shù)進(jìn)行組合。這可以根據(jù)最終用戶的應(yīng)用對(duì)亮度、角度分布和輻照度的要求進(jìn)行定制。根據(jù)這一定義，光引擎輸出的光譜分布可以通過(guò)加法組合，而這與傳統(tǒng)的寬光譜照明設(shè)備（電弧放電和白熾燈）形成鮮明對(duì)比。傳統(tǒng)的照明設(shè)備產(chǎn)生的光譜分布在物理上是不變的，只能通過(guò)選擇性的阻擋和衰減來(lái)調(diào)整。從工程學(xué)的角度來(lái)看，固態(tài)光源的第二個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是，它的輸出可以在強(qiáng)度（圖2、圖4）和時(shí)間（圖4、圖5）方面進(jìn)行精確控制。因此，光譜輸出單元件的差異很小（圖2），這使得光引擎應(yīng)用于不同成像系統(tǒng)時(shí)，所獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量能保持一致。

圖1.固態(tài)光引擎及其輸出光譜的概念圖。四個(gè)固態(tài)光源的輸出被合并入一個(gè)共同的光路，并通過(guò)光導(dǎo)耦合進(jìn)入纖維及或者圖像掃描儀。在實(shí)際操作中，光源可以是2-21個(gè)，具體數(shù)量取決于應(yīng)用要求。光源可以是LED、光導(dǎo)管或半導(dǎo)體激光器其中的一種或組合。它們的輸出可以經(jīng)過(guò)濾波（F）以細(xì)化光譜。輸出光的一部分會(huì)被分離出來(lái)，并導(dǎo)向參考光電二極管（rPD），以提供控制反饋。

在大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用中，不需要持續(xù)照明，甚至在某些情況下，會(huì)起到反效果，影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。通常情況下，照明與相機(jī)曝光會(huì)同步進(jìn)行。這里有兩個(gè)重點(diǎn)：首先是光源間的切換速度，其次是脈沖間隔的復(fù)現(xiàn)性。相比和機(jī)械濾光輪耦合的白光照明器（約50ms的切換時(shí)間），光引擎可以做到小于1ms的光源間切換（圖4），縮短了獲取多色圖像Z軸堆疊或者玻片掃描所需的時(shí)間。脈沖間的積分不變形（圖5）是決定延時(shí)圖像序列保真度的關(guān)鍵因素。每個(gè)脈沖的積分量化了在延時(shí)序列中每次曝光所需的照度。脈沖之間的照度差異越小，樣品動(dòng)態(tài)行為的敏感度就越能增加，這在圖像幀到幀的變化間可以體現(xiàn)。

圖2.28臺(tái)SOLA V-nIR光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光譜輸出曲線疊加。光引擎的總光輸出由光譜曲線所包圍的區(qū)域來(lái)量化。所有28臺(tái)光引擎的平均輸出功率為4558mW，標(biāo)準(zhǔn)差（n=28）為91mW，相當(dāng)于2%的方差系數(shù)（CV）。

圖3.SPECTRA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）的光譜輸出，包括LED、發(fā)光管或激光器。發(fā)光二極管和光導(dǎo)管的波長(zhǎng)規(guī)格（nm）代表了中心波長(zhǎng)（CWL）/半高全寬（FWHM），已經(jīng)通過(guò)內(nèi)置的濾光片來(lái)改進(jìn)光源輸出。功率（mW）是在光導(dǎo)（連接到顯微鏡或光學(xué)掃描儀）的遠(yuǎn)端測(cè)量得到的。集成三種不同類型的固態(tài)光源，可以在整個(gè)可見光和近紅外波段內(nèi)提供均勻的功率輸出。

圖4.由TTL觸發(fā)，AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）交替輸出485nm（約0.5ms寬）和560nm（約3ms寬）的脈沖（示波器記錄）。圖中顯示了兩條疊加的示波器軌跡，其中485nm的強(qiáng)度通過(guò)RS232串行命令從100%調(diào)整到55%，而560nm的強(qiáng)度保持不變。485nm和560nm的脈沖時(shí)間間隔為0.25ms。

圖5.模擬光電二極管（APD）檢測(cè)來(lái)自一臺(tái)5光源的AURA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR）發(fā)出的5ms光脈沖。圖中展示了10個(gè)脈沖序列，代表了每次數(shù)據(jù)采集中記錄的150個(gè)連續(xù)脈沖。計(jì)算了150個(gè)脈沖序列中每個(gè)脈沖的積分光輸出。對(duì)于555/28 nm輸出，150個(gè)脈沖的方差系數(shù)（CV）在555/28 nm脈沖串中為0.23%，在635/22 nm脈沖序列中為0.20%。其他三個(gè)源通道的CV值相似（0.15-0.25%）。

除了光譜帶寬（圖3）以外，固態(tài)LED、光導(dǎo)管和激光器之間的主要區(qū)別在于其光輸出的角度分布；LED和激光器之前的最大區(qū)別如表1所示。對(duì)于寬場(chǎng)顯微鏡應(yīng)用，LED光源配置為科勒照明產(chǎn)生的均勻照明，輻照度范圍為1-100mW/mm2。然而，單分子定位顯微鏡（SMLM）需要更高的輻照度，通過(guò)鏈接到顯微鏡臨界落射照明器（critical epilluminator）的CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），可以在樣品表明提供10^4mW/mm2的輻照度（圖6）。臨界照明的使用是由科勒照明在光學(xué)上的低效率所決定的，因?yàn)榭评照彰鞑](méi)有覆蓋整個(gè)光源表面或者發(fā)射光的全部角度分布。在臨界照明中，光源被直接成像到樣品平面上，這種方法更為高效，但對(duì)光源輸出中的任何空間不均勻性也更為敏感。臨界落射照明器的作用是均勻化任何空間上的不均勻性，以產(chǎn)生與典型sCMOS相機(jī)傳感器尺寸（~200mm2）相匹配的高輻照度照明場(chǎng)。

①輸出功率是在指定光導(dǎo)的遠(yuǎn)端測(cè)量的

②使用光導(dǎo)將光源輸出耦合到顯微鏡或光學(xué)掃描儀

③光導(dǎo)的數(shù)值孔徑

④光通量積決定了光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)有效利用光源輸出的能力。當(dāng)光源的光通量積與光學(xué)系統(tǒng)的光通量積緊密匹配時(shí)，可以獲得最佳性能。sr=球面弧度。

針對(duì)光驅(qū)動(dòng)生物技術(shù)以及工業(yè)應(yīng)用，優(yōu)化光源的選擇性需要全面考慮儀器的光譜、空間和時(shí)間要求，這些正是需要照明光源來(lái)支持的。通常一種技術(shù)盡可以滿足其中的部分要求，所以最佳策略即是混合多種技術(shù)來(lái)滿足全部需求。復(fù)雜的光引擎可以提供這樣一種集成的方法來(lái)混合光源，并克服任何給定技術(shù)的基本限制，例如，在熒光分析中，LED在500-600nm的光中由于臭名昭著的“綠色間隙”功率和亮度往往無(wú)法滿足；或者相對(duì)于毫秒級(jí)的切換時(shí)間，任何弧光燈的開/關(guān)不穩(wěn)定性；又或者廣譜光源進(jìn)行多路復(fù)用研究時(shí)，譜寬也帶來(lái)了限制。如今各種固態(tài)光源各有優(yōu)劣，只有仔細(xì)評(píng)估它們的優(yōu)點(diǎn)與局限性，才能為光驅(qū)動(dòng)生命和材料科學(xué)應(yīng)用的廣泛領(lǐng)域找到最合適的照面解決方案。

圖6.使用CELESTA光引擎（Lumencor, Inc., Beaverton OR），通過(guò)一根直徑800um的光纖耦合到安裝在尼康Ti/Ti2顯微鏡的臨界落射照明器上，并產(chǎn)生均勻的熒光玻璃成像。使用尼康60/1.4 NA Plan Apo物鏡和Andor的 Zyla 5.5 (2560 x 2160 pixels) sCMOS相機(jī)進(jìn)行圖像捕捉。圖表顯示了相機(jī)沿著標(biāo)記為紅色的對(duì)角線所記錄的灰度值。右上角的插圖展示了使用尼康10X/0.3 NA Plan Apo物鏡成像的同一樣品。