“OBIS激光器支持我們工作所需的快速直接數字調制，而且添加和移除這些即插即用激光器非常容易，它們都具有相同的形式和適用性。它們提供了豐富的數據。”--Jessica Houston，美國新墨西哥州拉斯克魯塞斯市新墨西哥州立大學化學與材料工程系教授。

挑戰

新墨西哥州立大學Jessica Houston教授的研究小組研究了在流式細胞術中使用時間分辨測量的獨特方法。該小組關注的一個重要領域是在化療藥物存在的情況下，使用熒光壽命測量法對癌癥細胞進行代謝圖譜繪制，評估其活力。另一個關鍵應用靶向基本細胞信號傳導和受體活性，使用F?rster(熒光)共振能量轉移(FRET)和熒光蛋白。

Houston指出，時間分辨流式細胞術與大多數現有的流式細胞儀應用程序明顯不同，后者依賴穩態熒光強度數據來執行計數和分選功能。商業上可買到的針對穩態數據優化的流式細胞儀不適合她的研究。因此，作為第一步，她的團隊必須建立自己的流式細胞儀。

有兩種眾所周知的測量熒光壽命的方法：在時域中使用脈沖激光或其他光源，或者在頻域中。Houston解釋說，“我們需要一臺高通量流式細胞儀來對大量細胞進行無損計數和/或分類，例如，用于研究血液中的轉移性癌癥細胞。而使用光子計數的時域測量無法支持必要的吞吐量。因此，我們決定在頻域工作，在頻域中，既定的方法是對細胞的興奮性在激光上，并關聯調制熒光發射中觀察到的相移。”

圖1時間分辨流式細胞儀的關鍵元件

圖2組裝時間分辨流式細胞儀

解決方案

休斯頓小組希望在他們的工作中除了研究NADH和FAD等代謝物的內源性熒光外，還能夠使用許多不同的熒光團。因此，他們需要多種激光波長來有效地激發所有這些不同的目標。他們還需要在光束指向和功率噪聲方面具有良好模式質量(即低M2)以及高穩定性輸出的激光器。

經過仔細評估，他們決定使用Coherent的OBIS激光器。Houston指出：“我們目前有幾種波長包括375 nm、405 nm、488 nm和633 nm的OBIS激光器。這些智能激光器非常適合我們的工作。除了高質量的輸出外，它們還支持我們工作所需的快速直接數字調制，加上添加和移除這些形狀和尺寸相同的即插即用激光器非常容易。”。“她指出，10瓦甚至100瓦的可用性是OBIS的另一個重要功能。這是因為她的許多實驗都是基于頻域壽命測量的，其中數字調制基本上將流動池的激光功率降低了50%

結果

休斯頓表示，她定制的流式細胞儀和越來越多的OBIS激光已被證明是一個成功的組合，并已為她的代謝譜研究和FRET工作提供了大量數據。

對于代謝譜，她引用了NADH的例子，其中測量的熒光壽命取決于該代謝物在被評估的細胞中主要處于結合狀態還是未結合狀態。這與細胞如何產生ATP有關，ATP是一種為大多數細胞活動提供能量的分子。正常細胞的代謝活性主要依賴線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)來產生ATP。但在許多類型的癌細胞中，糖酵解在ATP的產生中發揮著更大的作用，OXPHOS的能力降低。因此，休斯頓研究小組可以使用NADH壽命作為細胞對新治療反應的定量指標。

該小組還使用該系統快速獲取定量FRET數據。他們正在分析這些數據，以更好地了解蛋白質-蛋白質的相互作用，進行蛋白質構象研究，并探索酶的作用。休斯頓指出，“我們可以觀察供體熒光團是否處于猝滅狀態。我們還可以捕捉供體發射和受體發射。同樣，這些數據可以表明癌癥治療的有效性。總而言之，OBIS激光器和我們的高通量細胞儀確實提供了豐富的數據。”

審核編輯 黃宇