PCR因其出色的靈敏度、耐受核苷酸變異的能力以及執行多重檢測的能力而被廣泛認為是核酸檢測（Nucleic acid testing，NAAT）的金標準。超快速PCR系統的開發需要使用精密的儀器。為了促進即時檢測（POCT）應用的快速PCR，微流控技術因其在試劑分配、減少反應體積、自動化的方面的優勢而得到了廣泛的研究。其中，基于介電潤濕（Electrowetting-on-dielectric，EWOD）的數字微流控（Digitalmicrofluidics，DMF）可實現單個液滴精準操控，其高度可配置化有望實現在芯片實驗室應用中開發高效的工作流程。然而，基于EWOD的數字微流控系統在實現PCR熱循環中在高溫下容易形成氣泡。

此外，液滴在熱區之間的快速和頻繁移動會導致介電質擊穿（dielectric breakdown），在超快速的熱循環反應中溫度傳感器對液滴溫度傳感的不準確，這些都可能損害EWOD PCR的耐用性。這些技術挑戰阻礙了EWOD應用于現場診斷的即時快速PCR。

近期，澳門大學賈艷偉教授課題組報道了一種基于介電潤濕數字微流控平臺的超快速PCR，采用雙層加熱、多孔超疏水膜、隔溫槽、可溶性化學溫度傳感器等技術，綜合解決了介電潤濕數字微流控系統進行PCR熱循環的穩定性問題，使得PCR在3.7 ~ 5分鐘內完成40個熱循環，并與傳統PCR靈敏度相當。相關成果以“Sub-5-Minute Ultrafast PCR using Digital Microfluidics”為題發表在國際學術雜志Biosensors and Bioelectronics上。

具體而言，在該研究中，研究團隊開發了一個集成的EWOD數字微流控PCR系統，該系統解決了基于EWOD平臺上快速PCR的穩定性問題。系統原理及結構圖如圖1（a）所示。該EWOD PCR系統采用介電潤濕介導的液滴在不同溫區之間以移動的方式來完成PCR熱循環。

由于液滴在不斷快速移動中完成PCR熱循環，常規溫度傳感器不適用于檢測移動液滴中的溫度，另外，傳感器與液滴實際溫度之間的溫度偏差容易導致芯片上PCR效率降低。因此，研究團隊采用一種可溶性溫度傳感器（磺酰羅丹明B）來進行精確的液滴內溫度校準和調控，以實現高效的芯片上EWOD PCR。高溫變性溫區采用頂部和底部雙層加熱方式，減少了液滴的垂直溫度差，以確保液滴PCR的穩定性和準確性。

為了有效地消除高溫引起的介電擊穿和氣泡的產生，研究團隊采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）作為介電層來保護電極在高溫下不被擊穿。多孔膨體PTFE（expanded PTFE，ePTFE）覆蓋在半固化的PDMS上作為疏水層，由于其多孔的可膨化特性，不容易因高溫下的熱膨脹而破裂，從而消除了因表面疏水層損傷而產生的氣泡。

為了加快液滴PCR的反應速度，在頂部高溫薄膜加熱器的周圍設置了隔熱槽（Thermal isolation groove，TIG）（見圖1（b）），使得變性和退火/延伸兩個溫度區的水平溫度差增大，顯著減少了兩區之間的PCR液滴穿梭移動距離。最后，一種新型的移動電極聯鎖排列（Interlockingconfiguration）降低了移動電極對液滴大小的限制，使得大于0.2 μL大小的液滴可以在大于30°C的溫度差下連續移動，不受熱毛細管效應的影響阻礙液滴向高溫區移動。

圖1 基于介電潤濕數字微流控的超快速PCR系統原理圖

以上技術確保了PCR液滴在準確控溫的不同溫區穩定移動以進行熱循環，使得所開發的集成EWOD數字微流控系統在3.7 min內實現了40個循環的超快PCR。此外，對一種可逆的熱啟動試劑的應用（ThermaStopTM）消除了芯片上PCR的非特異擴增。連續梯度稀釋實驗（Serial dilutions）驗證了EWOD超快速PCR靈敏度與傳統PCR一致，其效率達到95.31%。



圖2 基于數字微流控的芯片上PCR

綜上所述，該研究介紹了一種基于EWOD數字微流控的穩健的超快速PCR系統。該研究采用的新材料及技術的組合有效增強了EWOD芯片的耐用性，可在超過30°C的溫度梯度上至少實現240個液滴穿梭。體積為0.6 μL 的超快EWOD PCR在3.7 ~ 5.0分鐘可實現40個熱循環。比傳統的PCR方法加速10 ~ 17倍。此EWOD系統還為NAAT用于檢測傳染性病原體、耐藥性分子檢測、法醫學和其他基于PCR的實際應用提供了可能性。

審核編輯：劉清