01 什么是CRISPR？

基因攜帶著生物體的遺傳信息，是儲存著生命的種族、血型、孕育、生長、凋亡等過程的一套精確的密碼，決定了生物體的性狀。

隨著科學(xué)研究的深入，某些場景我們需要人為改變這些密碼，調(diào)控生物體的各種性狀，諸如性別、毛色、膚色等等（當然性狀也受環(huán)境的影響），這種行為被稱為基因編輯。然而基因編輯并非易事，原因之一便是基因眾多，組成簡單生命最少要 265 到 350 個基因。這些基因上沒有標簽，無從知道哪段基因?qū)?yīng)了什么性狀。而且基因存在于微小的 DNA 中，尺度在納米級別。微小而繁復(fù)，使得基因編輯就像是在一團亂麻中找到想編輯的一段進行微型手術(shù)，難度不言而喻。

而在1987年被科學(xué)家在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一段“無法確定功能”的DNA成為了基因編輯技術(shù)的一大契機，這段DNA后期被稱為CRISPR。CRISPR是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，利用這個系統(tǒng)，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的基因組上敲除，這是細菌特有的免疫系統(tǒng)，是古菌和細菌抵抗病毒等外源遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。微生物學(xué)家掌握了細菌擁有多種切除外來病毒基因的免疫功能，其中比較典型的模式是依靠一個復(fù)合物，該復(fù)合物能在一段RNA指導(dǎo)下，定向?qū)ふ夷繕薉NA序列，然后將該序列進行敲除。許多細菌免疫復(fù)合物都相對復(fù)雜，其中科學(xué)家掌握了對一種蛋白Cas的操作技術(shù)，并先后對多種目標細胞DNA進行敲除。

通俗地說，CRISPR 技術(shù)是一種基因敲除（基因編輯）的技術(shù)。這種技術(shù)無視基因帶來的挑戰(zhàn)，它的強大之處在于能夠?qū)崿F(xiàn)精確的基因編輯，達到指哪打哪的程度，實現(xiàn)更高效率的基因敲除。在過去的十年里，圍繞著 CRISPR 技術(shù)的研究數(shù)量發(fā)生了爆炸式增長。這些研究帶來了諸多富有創(chuàng)新性的應(yīng)用，比如使用 CRISPR 技術(shù)對 DNA 納米結(jié)構(gòu)進行工程化設(shè)計或是通過基因編輯來治療遺傳疾病（例如鐮狀細胞病），這些突破性研究極大地革新了傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)。

02 CELESTA光源用于 CRaft-ID 成像

混合基因敲除篩選（Pooled genetic knockout screens）在功能基因組學(xué)界廣泛用于鑒定與細胞表型相關(guān)的基因，而基因敲除方法中最典型的則為CRISPR 方法。但是這類篩選方法大多采用比較粗獷的篩選指標，如生長速率、合成致死和熒光報告等方法。

近年來，隨著單細胞測序的普及，將其與混合基因敲除篩選法相結(jié)合，實現(xiàn)了全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的定量分析，大大提升了篩選的通量。但是，這些方法仍然不能對亞細胞層面的表型進行分析，如在成像層面能夠觀察到的時空分辨率下的一些表型。因此，將匯集的 CRISPR 基因篩選與細胞和亞細胞成像讀數(shù)相結(jié)合對于改善基于圖像的基因敲除研究中的表型定義至關(guān)重要。

2020年5月11日，加州大學(xué)圣地亞哥分校的華裔學(xué)者Gene W Yeo及其同事在Nature methods雜志上發(fā)表題為Pooled CRISPR screens with imaging on microraft arrays reveals stress granule-regulatory factors的研究論文。

在這篇文章中，作者將 Pooled CRISPR-Cas9 篩選與微筏陣列（又稱基因芯片）技術(shù)以及高內(nèi)涵成像相結(jié)合，開發(fā)了新技術(shù)“CRaft-ID”。作者選用了包含 >1,000 個 RBPs 的 gRNA 文庫（> 12,000 個 sgRNA）對細胞進行了感染，然后在 20 個微筏陣列上進行單細胞培養(yǎng)，篩選得到 119050 個應(yīng)激刺激后的單細胞集落和 5262 個未進行應(yīng)激刺激的對照集落。隨后采用自動高分辨率共聚焦成像來識別應(yīng)激顆粒的調(diào)節(jié)因子，并開發(fā)了機器學(xué)習(xí)工具來識別 CRISPR 基因敲除后應(yīng)激顆粒豐度降低的基因克隆。

其中，微筏陣列的共聚焦成像是使用與 CrestOptics X-Light V2 L-FOV 旋轉(zhuǎn)盤共聚焦耦合的虹科 CELESTA 光源完成的。在這種大通量成像應(yīng)用中，顯微鏡光源需要具有極佳的光源強度和長時間工作的穩(wěn)定性，虹科CELESTA 光源滿足所有嚴苛要求。虹科 CELESTA 光源的405 nm，520 nm，546 nm和638 nm線分別用于激發(fā)DAPI，mCitrine，mCherry和Alexa Fluor 633的熒光。該篩選鑒定并驗證了六種以前已知的應(yīng)激顆粒調(diào)節(jié)劑，以及17種RNA結(jié)合蛋白（RBP）。當它們耗盡時，可減少亞砷酸鈉誘導(dǎo)的人體細胞中應(yīng)激顆粒，這為應(yīng)激顆粒提供了新的生物學(xué)見解。基于虹科 CELESTA 光源構(gòu)建的 CRaft-ID 篩選平臺拓展了 CRISPR 篩選在高內(nèi)涵成像中的應(yīng)用，使得我們能夠?qū)喖毎麑用婧图毎螒B(tài)的表型進行遺傳因子分析，而這些在以前是無法實現(xiàn)的。由于該方法采用的微筏陣列、通用的CRISPR文庫、現(xiàn)成的共聚焦成像技術(shù)和基于 PCR 的 DNA 測序，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。

03虹科CELESTA光源介紹

虹科CELESTA

虹科 CELESTA 和 CELESTA quattro 光源包括4-7個可單獨控制的固態(tài)激光光源陣列（在400-800nm范圍提供7個可選波長），并且支持快速切換。CELESTA 光引擎在1.5mm直徑光纖的遠端出光，其7個激光器中的每一個都能提供約1W的輸出功率。

同樣，CELESTA quattro 光源以相同的輸出功率規(guī)格提供了一個具有性價比的4或5通道選擇。激光輸出與復(fù)雜的控制和監(jiān)測系統(tǒng)相結(jié)合，為旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、空間分辨率轉(zhuǎn)錄組學(xué)和其它高級成像應(yīng)用提供所需的高清晰度性能。