寫在前面

在復雜的異質標本中同時識別和定位多個分子或分子組裝體的能力長期以來一直是推動熒光顯微鏡在生物和物理科學中應用的主要優勢。例如，自 1986 年以來，使用四種光譜不同的熒光團鑒定 DNA 的腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤 (ATCG) 堿基，已成為大多數自動化 DNA 測序技術的基礎 [1]。

在下文中，小編為大家介紹了幾種多重熒光檢測的方法及其特點，并展示利用虹科固態光源實現的多重熒光技術的應用案例。

01 基于光譜鑒別的

多重熒光檢測

目前，大多數多路檢測方案都基于光譜鑒別，因為與基于時間或空間鑒別的方法相比，它在技術上不太復雜且成本更低[2]。該技術原理主要利用雙分子標記的熒光染料和熒光蛋白 (FP) 的光譜特性，如圖 1 所示。

在這個例子中，兩種熒光標記的激發光譜和發射光譜具有明顯的光譜重疊以及分離的區域。因此，可以通過特征的激光區域來實現不同熒光團的激發。當兩種熒光團都存在時，比如利用475nm的激光可以實現兩種熒光團同時倍激光。而只有在大于 550 nm 的波長下才有可能選擇性激發一種熒光團而不激發另一種熒光團。通過這種對比成像方式來獲取更多特征圖像。

圖 1. Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 555 熒光團的標準化熒光激發和發射光譜。發射光譜重疊區域以綠色陰影顯示。灰色陰影區域表示用于獲取圖 2 中圖像 A-C 的激發帶寬 (475/28 nm)

基于圖 1 中的兩種熒光團的光譜位置，有研究者對麂皮成纖維細胞實現標記，標記有 Alexa Fluor 488 phalloidin（肌動蛋白）和小鼠抗 OxPhos 復合物 V + Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgG（線粒體）。

實驗中使用虹科 SPECTRA 光源、Andor Zyla 5.5 sCMOS 相機和 Nikon Ti2 顯微鏡獲取的同一區域的四張 60X 熒光圖像，如圖2所示。圖像不會因串擾而退化，因為激發帶寬 (555/28 nm) 與 Alexa Fluor 488 的激發光譜沒有很大程度的相交，從而實現多路熒光檢測的效果。

圖 2. 使用單波段激發獲得的肌動蛋白細胞骨架圖像與線粒體細胞圖像然而，光譜鑒別的方法并不能適用所有場景。目前光譜鑒別的最大局限在于光譜串擾，其適用范圍僅限于大約五個目標（如圖 1 和 2）。在上面的例子中，雖然只有兩個熒光標記，但是它們的激發和發射波長跨越了整個可見波長范圍（ 400–700 nm）。而在當前使用的數千種不同染料和 FP 中，熒光激發和發射的光譜帶寬幾乎沒有變化，較寬的光譜范圍限制了光譜鑒別的多重熒光檢測技術的進一步應用。目前，大規模生物系統的基因組和轉錄組研究可能需要同時識別和定位成百上千的分子靶標，這種高度并行的分析超出了基于光譜鑒別的多路復用的能力。盡管已經開發出具有窄發射光譜的量子點納米晶體 [3]，但與有機染料相比，這種改進的代價是熒光團尺寸增加了一個數量級以上，這反過來又阻礙了它們在雙分子標記應用中的實用性 。

02 基于SPECTRA光源的

多重染色成像

由于光譜鑒別技術在多重熒光檢測的局限性，研究者們為了擴大可檢測目標數量而引入的一些新技術。

近期，有研究者提出，提出了一種直接的方法，可以從連續的全腦切片中生成一組綜合生物標志物的讀數，表征所有主要的腦細胞類型，范圍從亞細胞區室、單個細胞、局部多細胞生態位到每個切片的全腦區域。通過對濾光片和標記試劑的仔細優化，以及對原始熒光圖像數據的串擾和非特異性標記進行校正的穩健解混算法的應用，已經證明了腦組織的 10 色多重成像 [5]。

圖3 多重 IHC 染色和多光譜廣域落射熒光成像設備[5]

該成像平臺在從紫外到近紅外（350-800?nm）的整個可用光譜范圍內，充分利用了廣泛選擇的光譜兼容熒光團的可用性。10 色多光譜成像所需的寬視場落射熒光顯微鏡組件包括配備高分辨率物鏡、高靈敏度數碼相機、廣譜光激發源和 10 個獨立的激發/二向色/發射濾光片組經過優化，可檢測多達 10 種常用或定制的光譜兼容熒光報告分子，具有最小的光譜串擾。

圖 4. SPECTRA Light Engine 的光譜輸出經過優化，可選擇性激發用于 10 重免疫熒光檢測的熒光染料 [5]。

圖 4顯示了針對本技術中使用的熒光染料面板的選擇性激發而優化的虹科SPECTRA 光源 的光譜輸出。光源結合了 LED、光管和激光器，以實現所需的光譜激發分布和所需的光功率。使用相同的熒光染料面板和濾光片配置，可以通過連續幾輪的剝離、重新標記和成像來增加多路復用的程度。

通過五個循環的剝離、10 色重新標記和成像，以及專業的隔離算法與深度學習，已經實現在整個大鼠腦冠狀切片中同時定位 50 個生物標志物目標 [5]。

03 基于CELESTA光源的

MERFISH技術

通過將空間和時間維度添加到基于光譜辨別的多路復用中，已經開發出能夠同時識別和定位成百上千個生物分子目標的多路復用技術 [6]。在相當大的程度上，這些技術利用核酸雜交既可以識別 DNA 和 RNA 分子靶標，也可以作為產生熒光染料順序排列的模板。?

圖 5. 用于基因表達分析的分子條形碼掃描原理。帶有激發和發射濾光片的掃描儀可識別由藍色、綠色、黃色和紅色圓圈表示的 4 種染料，從探針位置 1 到 6 讀取熒光信號，以揭示雜交核酸靶標的編碼身份。基于此原理的MERFISH（多重誤差魯棒熒光原位雜交）技術可以實現大規模多重單分子成像，能夠同時測量單細胞中成百上千個目標 RNA 的拷貝數和空間分布 [9]。在 MERFISH 中，目標相關的條形碼被迭代讀取。首先，編碼寡核苷酸探針與目標 RNA 雜交。然后連續添加熒光染料標記的讀出寡核苷酸探針，在單分子水平上進行空間定位，然后熄滅。讀出探針必須專門與編碼探針雜交，而不是與細胞核酸雜交。編碼探針身份在連續成像周期中累積，如果通過讀出探針的雜交檢測到編碼探針，則分配二進制位值“1”，否則分配“0”值。通過在每個循環中同時檢測具有光譜不同熒光標記的讀出探針，可以減少雜交 + 成像循環的數量，從而減少完成數據采集所需的時間。圖 5. CELESTA 激光引擎光譜輸出針對 MERFISH 多路復用單分子成像進行了優化。

MERFISH 需要與典型 sCMOS 相機傳感器的尺寸 (~200 mm2) 相匹配的高強度、空間均勻的照明場。為了滿足這一要求，研究者們在顯微鏡中安裝了一個與虹科 CELESTA 光源（圖 5）的光纖輸出耦合的專用臨界落射器，通過具有高數值孔徑的高放大倍率物鏡在樣品平面上提供每平方厘米1-10W的光強度。

顯然，高度平行的熒光標記生物分析，那些需要多路復用超過簡單光譜辨別能力的分析，可以通過明智地選擇熒光、濾光片、微調激發照明和智能算法來實現。分子條形碼等巧妙的標記策略也可用于各種生物樣品，以增強來自高度復雜組織標本的生物分子信息的光譜辨別和空間分布。

在虹科固態光源的純凈、明亮、穩定的照明性能的支持下，能夠有效克服可見波長內定義的歷史限制，能夠實現最高通量、最優質量的多路復用熒光檢測效果。

虹科固態光源介紹

虹科SPECTRA

虹科SPECTRA固態光源擁有8個可單獨控制的固態光源，提供了空前的性能。每個色帶在液體光導的末端提供大約半瓦的光功率。組成光源包括LED，專利的冷光燈和激光光源。

光源的輸出通過內部集成的帶通濾光片優化。光輸出端口具有內置適配器，可通過標準的3mm直徑的液態光導LLG連接到顯微鏡和其他生物分析儀器。為滿足需要快速（10us）切換的應用，所有八個信號源均提供了TTL觸發輸入。

虹科CELESTA

虹科 CELESTA 和 CELESTA quattro 光源包括4-7個可單獨控制的固態激光光源陣列（在400-800nm范圍提供7個可選波長），并且支持快速切換。CELESTA 光引擎在1.5mm直徑光纖的遠端出光，其7個激光器中的每一個都能提供約1W的輸出功率。

同樣，CELESTA quattro 光源以相同的輸出功率規格提供了一個具有性價比的4或5線選擇。激光輸出與復雜的控制和監測系統相結合，為旋轉盤共聚焦顯微鏡、空間分辨率轉錄組學和其它高級成像應用提供所需的高清晰度性能。