近十年來，熒光激活液滴分選技術（FADS）快速發展，已成為一種強大的超高通量篩選工具，廣泛應用于酶、代謝產物和抗體篩選。

高靈敏度熒光偶聯策略（FCSs）是FADS應用拓展的關鍵技術，可將酶活性、代謝產物濃度、抗體親和力等性質與熒光信號進行偶聯，實現目標物質定量檢測，是FADS應用發展關鍵環節之一。

截止目前，一系列FCSs已經被開發，極大地擴展了FADS的應用（圖1）。



圖1FADS系統工作流程圖

據麥姆斯咨詢報道，近日，中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所醫藥酶工程研究中心馬富強研究員團隊在國際TOP期刊Biotechnology Advances上發表了題為“Fluorescence coupling strategies in fluorescence-activated droplet sorting (FADS) for ultrahigh-throughput screening of enzymes, metabolites, and antibodies”的綜述論文。

該綜述系統性回顧了十多年來不同分析物質（酶、代謝產物、抗體）熒光偶聯液滴微流控研究的最新進展，并根據熒光偶聯策略原理，將其分為四大類，包括熒光底物分析策略、酶聯熒光分析策略、基于生物傳感器的熒光偶聯策略、基于抗體親和力的熒光偶聯策略。作者分別介紹了四類FADS的原理，并將各類策略液滴微流控研究進展進行了分析和總結。

熒光底物分析策略是酶篩選中最常用的熒光偶聯方法之一。通過將熒光團與特定的官能團共價結合，以阻止其產生熒光信號。當目標酶催化熒光底物釋放官能團，生成的熒光團產生熒光信號，其信號強度應與酶活性成線性關系，從而實現定量檢測。

在過去十年中，已有多種熒光底物被設計、開發并應用于類酶活性檢測中，包括水解酶、氧化還原酶、和裂解酶等（表1）。與此同時，熒光底物策略可用于宏基因組文庫篩選或者難以培養的細菌群體中鑒定新的酶、新進化的催化酶。

表1 熒光底物策略在酶篩選中應用案例

FADS技術可以從大型突變庫或難以培養的混合環境樣品中篩選出所需的酶或細胞，但這些篩選所針對的大多數自然酶或代謝產物都是非熒光性的，不適合FADS系統。酶聯熒光分析策略成為FADS應用另一關鍵技術，可將非熒光代謝產物的濃度或酶活力轉化為熒光信號，實現熒光定量檢測。

該綜述對一系列的酶，如氧化酶、還原酶以及轉移酶等，偶聯相應底物特異性氧化酶，實現酶活力或代謝產物濃度分析和檢測（表2）。

表2 酶聯熒光策略在酶及代謝產物生產菌株篩選中的應用案例

生物傳感器是基于目標分析物與檢測信號成線性關系，通過信號強度進行分析、檢測、定量的一類裝置。熒光生物傳感器是一種基于熒光分子產生信號的生物傳感器，可設計多種識別元件，包括適配體、抗體、酶等。其中，適配體由RNA或DNA寡核苷酸構成，可特異性地結合目標分子，是生物傳感器理想的識別元件。

將熒光分子納入設計中，在熒光強度發生變化時可以監測目標分子與識別元件的結合，實現目標分子的實時檢測和定量分析。這些生物傳感器在多種場合中均有應用，包括體外試驗和體內成像。基于此，該綜述主要介紹了基于轉錄因子（TF）的熒光生物傳感器（即基于抑制型-或激活熒光生物傳感器）、基于RNA的熒光生物傳感器以及基于FRET的熒光生物傳感器，有效地將目標分析物濃度及性質轉化為FADS超高通量篩選中的熒光信號。

表3 基于生物傳感器熒光偶聯策略在酶及代謝產物生產菌株篩選中的應用案例

抗體廣泛用于研究和臨床診斷，并用于治療各種疾病。近年來，治療性單克隆抗體數量在市場上顯著增加。2021年全球單克隆抗體市場規模為1144.3億美元，預計到2025年將增長至1795.6億美元，年增長率（CAGR）估計為2021年至2025年11.9%。2022年全球銷售最高的藥物中有幾種是抗體藥物，包括Humira、Keytruda、Stelara和Opdivo。這凸顯了抗體作為治療感染、自身免疫和腫瘤性疾病的強效治療劑的重要性。單克隆抗體可以通過噬菌體展示和相關技術高效篩選結合。

然而，由于常規雜交瘤篩選中只能容納幾千個克隆體，成本高、通量低。FADS在抗體篩選應用中優勢突出，皮升或納升級別的反應體系降低了成本并增加了通量，使得抗體分泌的定量、高靈敏度、實時動力學測量成為可能。本綜述中，基于抗體親和力作用，分別介紹了熒光聚集分析技術、酶活性抑制分析技術、親和力響應報告細胞分析技術在功能性抗體篩選中的應用及拓展。

圖2 基于抗體親和力熒光偶聯策略在抗體篩選中的應用案例示意圖

綜上所述，作者綜述了不同類型熒光偶聯策略及其應用發展，為液滴微流控系統在酶、代謝產物及抗體篩選應用拓展提供了重要的基礎理論依據。該研究得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、中國科學院青年創新促進會會員資助計劃等資助。

審核編輯：劉清