呼吸道病毒感染由于其高致病率及致死率，成為世界各國人民發病和死亡的主要原因之一。引起上呼吸道感染的病毒種類較多，尤其是甲型流感病毒新型H5N1（FluA-H5N1）、甲型流感病毒新型H1N1（FluA-H1N1）、乙型流感病毒（FluB）、冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）、新型冠狀病毒（2019-nCOV）等病毒在近一個世紀以來的多次大規模流行，給人類的生命健康和社會經濟帶來巨大傷害。

這些上呼吸道感染的病毒引起的感染癥狀和季節性流行病毒特點相似，為避免造成群聚傳染，快速鑒別呼吸道病原體的檢測顯得尤為重要。

據麥姆斯咨詢報道，近期，拱北海關技術中心等科研機構于《熱帶醫學雜志》發表研究性論文，將RT-qPCR技術和數字微流控技術相結合，建立一種基于數字微流控RT-qPCR芯片技術的上呼吸道易感病毒多靶標快速檢測方法。實現一種以少量樣品同時快速檢測多個呼吸道病原體的檢測技術。該方法滿足了目前市場對呼吸道病原體的高診斷率的需求，同時還為精準醫療提供了新的檢驗手段。

為實現一個芯片多個項目的檢測功能，研究人員將6個引物（2019-nCOV-N引物、2019-nCOV-Orf1引物、FluA-M1引物、FluB-HA引物、SARS-65引物、MERS-62引物）和相應探針分別預存到芯片的各個反應點中，并向反應點添加引物預存液，而后將芯片置于風干干燥箱中干燥，接著將干燥好的芯片取出進行封裝處理。

芯片設置6個反應點，從左往右依次是預存的2019-nCOV-N引物、2019-nCOV-Orf1引物、FluA-M1引物、FluB-HA引物、SARS-65引物和MERS-62引物

為了驗證該數字微流控RT-qPCR芯片的檢測性能，研究人員使用TE緩沖液將陽性質粒10倍稀釋為10 pg/μL至0.01 fg/μL的濃度梯度，并根據RT-qPCR反應體系和反應程序，完成各單項目的引物、探針在AGS4800實時熒光定量PCR儀上的檢測下限檢測。

同樣，對相應濃度的質粒使用數字微流控芯片完成實時熒光RT-qPCR反應。如圖2所示，6種引物在AGS4800實時熒光定量PCR儀上均可檢出對應的陽性質粒，對于10 pg/μL的質粒均可在20個循環之前檢出，且45個循環內無非特異性擴增。

圖2 檢測試劑測試結果

此外，FluA、FluB、SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCOV這5個檢測項目使用PCR儀的25 μL體系最低可檢出0.01 fg/μL的質粒，而數字微流控RT-qPCR芯片法每個反應最低可檢出0.1 fg/μL的質粒，與PCR儀2 μL體系靈敏度相同。根據公式，質粒拷貝數濃度 =（質粒濃度×摩爾系數）/（質粒長度×堿基對平均分子量），分別計算2種方法中的每個反應的質粒拷貝數可得知，上述2種方法在2~25μL的體系下檢出限均為12~15拷貝/反應，檢測下限基本一致（圖3）。

圖3 數字微流控RT-qPCR芯片的檢測下限測試結果

最后，為明確該數字微流控RT-qPCR芯片的檢測靈敏度和特異性，研究人員同時使用數字微流控RT-qPCR芯片和RT-qPCR儀檢測20個臨床標本（包含新冠病毒2例，甲型流感8例，乙型流感6例）的5項呼吸道病毒項目，共計100個測試反應，見表1。

結果顯示微流控芯片除樣品7出現一次對甲型流感病毒漏檢外，其余陽性樣品均檢出對應病毒，對于20個樣品的5種病毒的總靈敏度為94%，總特異性為100%。Kappa值 = 0.962，兩個檢測方法具有高度一致，并且差異有統計學意義（P < 0.05）。

表1 PCR儀和微流控芯片檢測臨床樣本結果匯總

綜上所述，該研究將多個RT-qPCR檢測項目與數字微流控檢測芯片結合，建立了在一次反應中同時檢測多個項目的數字微流控RT-qPCR芯片。該數字微流控芯片RT-qPCR法可以以最少的樣本量快速檢測多個項目，自動化程度更高，可以提高上呼吸道病毒檢測的效率，提高應對大規模疫情的快速反應能力。

審核編輯：劉清