藥物療效的臨床前分析是藥物開發的關鍵。然而，傳統的群體細胞分析只能靜態評估平均群體行為，對藥物逃逸細胞的分辨率較低。而對療效的不準確評估，往往要么導致高估候選藥物的療效，但無法在臨床得到證實，要么則導致有價值的候選藥物被拒。延時微流控顯微鏡是一種高時空分辨率的藥物表征方法，但目前還難以大規模應用。

據麥姆斯咨詢報道，近期，法國巴黎大學（Université de Paris）的研究人員報道了一種以液壓氣動機制運行的模塊化微流控細胞培養室，其特點是具有特別高的縱橫比。通過復制該功能單元，并將其與雙入口微流控稀釋系統相結合，研究人員得到了一個可以同時設置五種藥物濃度條件的微流控平臺。

該微流控平臺由兩個入口和一系列蛇形微通道組成，這些微通道依次通過五個獨立的腔室組實現對流入溶液的滴定。最終，通過寬視場倒置顯微鏡對這些腔室進行時間分辨觀測，研究人員能夠直接捕捉到單個分枝桿菌細胞在給藥前、給藥中和給藥后的生長情況、死亡率和存活率。

圖1 連接到多通道微流控流量控制器（Fluigent）的五條件微流控裝置示意圖。第一個通道首先連接到三個獨立的儲液池，隨后依次連接到一個由軟件控制的雙向位置閥，以實現不同濃度條件的切換。

生成不同的梯度模式來模擬藥物動力學

如圖2a所示，為了在五條件微流控平臺中產生濃度梯度，研究人員從進樣口注入兩種不同的溶液，使之分別流入兩個獨立的蛇形微通道。隨后，后者分叉為外部和內部兩個蛇形微通道，其中外部蛇形微通道中的溶液保持原來的濃度，而內部的蛇形微通道充當混合器，使流入的溶液在此混合。

接著，三個蛇形微通道中的每一個都繼續分叉，產生兩個外部蛇形微通道和兩個混合器，之后進一步分叉并產生最后一個包含兩個外部蛇形微通道和三個內部混合器的稀釋水平。在每個稀釋水平下，蛇形微通道內的流量是相同的，而在每個分支的連接部分，流向系統外部的流量更大，流向系統內部的流量更小。

這種網絡結構產生的濃度梯度是線性的。從最后一個稀釋水平開始，溶液流入五個獨立的腔室組（C1-C5），每個腔室組有四個微腔室。最后，每組腔室連接到相同的出樣口，以最大限度地提高整個微系統的流動穩定性。

圖2 五條件平臺的梯度構造表征

此外，為了量化濃度梯度，研究人員將溶入異硫氰酸熒光素（FITC）的7H9培養基溶液注入第一個進樣口，并將不含熒光的7H9培養基溶液注入第二個進樣口。研究發現，在穩態下，測得的梯度與理論預期相差最小，此時，FITC溶液在C1中未稀釋，在C2中稀釋到約72%，在C3中稀釋到約48%，在C4中稀釋到約25%，在C5中不存在。

為了模擬典型的PK曲線，研究人員還生成了脈沖形的FITC梯度，其峰值濃度與靜態梯度得到的濃度不同。其中，FITC溶液在峰值濃度時，其在C1中未稀釋，在C2中稀釋到約82%，在C3中稀釋到約54%，在C4中稀釋到約21%，在C5中不存在。

通過雙向開關閥，在不同時間間隔交替灌注非熒光和熒光溶液，可以產生靜態和動態梯度。有趣的是，只有在進樣口上游集成了電容時，才能獲得模擬PK的脈沖形梯度。總之，通過將稀釋樹網絡與微流控培養室集成，研究人員創建了一個適合在空間和時間上滴定分子的微流控平臺。

莫西沙星對恥垢分枝桿菌微菌落的作用具有劑量和時間依賴性

為了測試平臺的運行，研究人員研究了不同藥物濃度對恥垢分枝桿菌生長速度的影響。其中，研究人員重點研究的莫西沙星是一種靶向II型拓撲異構酶DNA旋轉酶的氟喹諾酮類藥物，其在抗擊多藥耐藥菌株的抗結核治療過程中發揮著至關重要的作用。為了監測莫西沙星對靶標的影響，研究人員通過將系統中的mCherry基因與GyrA染色體融合，生成了GyrA的紅色熒光報告基因。

研究發現，在不存在莫西沙星的情況下，細菌呈指數級生長，但隨著藥物濃度的增加，細菌的微菌落大小顯著地逐漸減小，在最高濃度時，細菌的生長迅速停止。且與未給藥的細胞相比，研究人員觀察到最高濃度的莫西沙星顯著抑制靶標，而較低濃度的莫西沙星會誘導靶標。

此外，在給藥的前6小時，研究人員沒有測量到在不存在藥物或存在不同濃度藥物的情況下微菌落生長速率的顯著變化。而在給藥的最后6小時，微菌落生長速率開始顯著放緩，并在無藥物的恢復階段繼續下降。此外，研究人員觀察到在相同給藥濃度下，克隆微菌落生長速度存在顯著異質性。

最后，研究人員檢驗了體外模擬的PK參數與生長速率是否相關。有趣的是，研究人員發現，當給藥濃度高于最小抑制濃度（MIC）時，細菌生長速率與劑量（R2 = 89.8%）和時間（R2 = 90.8%）之間都存在負相關關系。相比之下，研究人員發現生長速率與曲線下面積（AUC）和MIC的比值之間沒有顯著相關性。

總之，研究人員利用該微流控平臺在高細胞分辨率下分析了PD性質以及PD-PK關系，發現莫西沙星對恥垢分枝桿菌微菌落的作用具有劑量和時間依賴性。

圖3 莫西沙星脈沖梯度對恥垢分枝桿菌GyrA-mCherry報告基因的作用

總的來說，這項工作是首個用于生長緩慢的細菌細胞的單細胞劑量-反應試驗的概念驗證工作，該研究中創建的微流控平臺具有良好的在高時空分辨率下研究PK-PD關系的能力。此外，與間接推斷藥物耐受細胞存在的群體細胞分析方法不同，該微流控平臺允許直接檢測不同的單細胞在藥物作用下隨時間的變化，為藥物發現提供技術進步。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41598-022-24175-9

審核編輯：劉清