尿路感染（Urinary tract infections，UTIs）是一種發病率和死亡率較高的感染性疾病，嚴重威脅人體健康和生命安全。尿路感染主要由大腸埃希菌（E.coli）引起，因而快速的病原學診斷對于合理使用抗生素和抑制細菌耐藥性的產生具有重要作用。

數字化核酸分析，如數字PCR技術，是一種基于大規模分散體系的絕對定量分析方法，具有不依賴標準品的絕對定量分析能力，然而，現有數字化核酸分析產品，通常采用離線式模式，這些設備普遍體積龐大，同時多步離線操作耗時較長，并且容易操作失誤和交叉污染，因而不適用于病原的現場快速檢測。

據麥姆斯咨詢報道，為了解決上述問題，來自華南理工大學及桂林電子科技大學的聯合研究團隊建立了一種集成式微流控液滴數字化等溫擴增（LAMP）方法，用于尿路感染細菌的快速檢測。相關研究成果以“集成式微流控液滴數字化等溫擴增用于尿路感染細菌快速檢測”為題，發表在《分析化學》期刊。

芯片設計與制作

研究人員設計并制備了一種集成了核酸提取、液滴發生和數字化核酸分析的微流控芯片。芯片包含三層結構（圖1A），共有4個核酸提取單元的微池，液滴發生單元的水相通道入口與核酸提取單元的LAMP預混液池底部對接，油相通道入口與儲油池底部對接。液滴收集池底部設置微柱陣列（直徑100μm，間距80μm），用于支撐芯片頂層。

圖1 芯片結構及操作流程圖

（A）芯片由頂層、中間層和底層組成：頂層包含核酸提取單元的樣品池、洗滌液池、洗脫液池、預混液池以及滴液發生單元的儲油池，中間層包含液滴發生單元的液滴發生器和液滴收集池，底層為無結構平板玻璃；（B）微流控芯片上的核酸提取與液滴發生：（a）將樣品混合液、洗滌液、洗脫液和LAMP混合液分別加載到指定的微池，（b）用磁力驅動磁珠分別進入含有洗滌液和洗脫液的液滴，（c）通過往復轉移磁珠引發洗脫液液滴與LAMP混合液液滴融合，（d）注射器真空驅動液滴發生。

集成式微流控數字化核酸分析

核酸提取單元采用微流控序列液滴設計。程序化操控磁珠順序通過含有樣本/結合緩沖液、洗滌液和洗脫液的液滴，即可自動完成核酸-磁珠結合、核酸洗滌和洗脫。其后，拖動磁珠往返運動，引發洗脫液液滴與反應預混液液滴融合，即可構成完整的等溫擴增反應體系。液滴發生單元使用注射器負壓驅動油相和水相進入液滴發生器。十字型液滴發生器處，在油相剪切力作用下，水相被切割形成單分散液滴。為了調節水相流速，水相引入通道還設置了蜿蜒形的阻力調節器。

圖2 芯片核酸提取方法的優化

（A）使用試劑盒提供的洗滌液提取核酸后的液滴LAMP；（B）使用酸化的1 × LAMP緩沖液作為洗滌液提取核酸后的液滴LAMP；（C）細菌裂解效率；（D）核酸回收效率。

液滴數字化LAMP

本研究采用濃度為8.835 × 10?CFU/mL的E.coli gDNA樣品進行液滴LAMP，通過熒光成像分析確定陰性和陽性液滴的判定方法。如圖3B所示，當以陰性液滴的平均熒光強度加3倍方差作為閾值時，獲得的陽性率（29.46%）最接近理論值（30.15%），因此確定其為陽性判定閾值。

圖3液滴數字化LAMP反應條件的優化

（A）加熱前后液滴體積變化情況；（B）陰陽性液滴區分閾值的判定，P代表陽性液滴，N代表陰性液滴；（C）EvaGreen核酸染料濃度的優化；（D）BST聚合酶濃度和反應時間的優化。

集成式數字化LAMP用于細菌定量分析

集成式數字化LAMP的整個分析過程可在1.5h內完成。采用集成式微流控芯片液滴數字化LAMP方法 E.coli ATCC25922菌懸液進行了分析。由于液滴數字化LAMP的檢測靶標為細菌gDNA，因而測得的核酸濃度等于細菌濃度（圖4）。由于數字化核酸分析技術對于病原菌的定量分析的精度高于定量培養法，并且引發尿路感染的細菌濃度范圍較寬，因而集成式數字化LAMP可滿足病原細菌定量檢測的要求。

圖4集成式微流控液滴數字化LAMP用于E.coli定量分析

（A）梯度濃度稀釋細菌樣本的液滴數字化LAMP結果；（B）液滴數字化LAMP測得的核酸濃度與平板計數測定的細菌濃度的線性相關性。

集成式微流控數字化LAMP用于尿路感染細菌檢測

利用建立的集成式微流控液滴數字化LAMP方法對13例E.coli尿路感染臨床樣本進行了分析。本方法與傳統細菌平板計數法對于E.coli尿路感染的判定具有高度一致性。

綜上所述，研究人員建立了一種集成式微流控芯片液滴數字化等溫擴增方法，可在同一芯片上完成基于液滴的核酸提取、樣本分散以及核酸等溫擴增等過程，實現從樣品輸入到結果輸出的全流程檢測。采用模式樣本和實際臨床樣本的測試結果確認了本方法的可靠性。本方法自動化程度高、操作簡便、定量分析精度高、分析速度快，適用于醫療資源有限條件下的感染性病原現場快速檢測。

論文鏈接：

https://doi.org/10.19756/j.issn.0253-3820.221085

審核編輯 ：李倩