光片熒光顯微鏡的優點

光片熒光顯微鏡(LSFM)是一種可以對活體標本進行快速且無光毒性3D觀測的強大顯微成像技術。LSFM技術將寬場成像的速度與適度的光學切片和低光漂白特點相結合，因此也被稱為選擇性平面照明顯微鏡(SPIM)，或簡稱為“光片”。SPIM或LSFM共同的定義特征是從側面對焦平面進行平面照明，在任何給定時間，僅對樣品的一小部分進行照明，因此與寬場輻射熒光相比，可以最大限度地減少光損傷并提供改善信噪比的光學切片。此外由于圖像是以寬場(2D平行)方式收集的，因此光片成像比一次僅檢測一個像素的點掃描共聚焦顯微鏡快得多。

由于三個關鍵特性，光片熒光顯微鏡正成為體積成像最流行的技術之一：

1.激發點被限制在焦平面附近，光損傷被最小化，生物可以存活更長的時間;

2.容易獲得良好的光學切片，通常接近共聚焦顯微鏡;

3.采集速度非常快，比傳統的共聚焦顯微鏡快幾個數量級。

從本質上講，光片顯微鏡通常基于熒光技術，一般來說，研究中的樣品需要正確標記才能成像。使用彈性散射光可以生成未標記樣本的圖像，但目前主要的障礙是這些圖像通常受到散斑的影響。為了解決這個不便，Pablo Loza-Alvarez, Omar Alarte, David Merino of ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques with Diego Battista and Giannis Zacharakis of Foundation for Research and Technology-Hellas使用來自樣本的彈性散射光來生成圖像，以避免對樣品的標記。他們使用了低時間相干的超連續譜激光光源作為一種候選光源，以減少散射光在光片顯微鏡圖像中固有的散斑。

在這項工作中，他們提出了一種基于光片的新型光學裝置，該裝置采用了三種方法來處理彈性散射圖像帶來的散斑，分別是偏振濾波、降低激發光源的時間相干性和降低光片的空間相干性，這些策略可以在不依賴熒光標記的前提下使具有挑戰性的生物樣品結構特征的原始光片彈性散射成像成為可能。

光片顯微鏡中的偏振和相干控制

在該實驗中，彈性散射光片顯微鏡的主要部件是來自西班牙FYLA公司的超連續譜光纖激光器，它發出從可見光到紅外光的寬帶光譜。該光源具有非常寬的光譜帶寬，同時，它呈現出非常低的時間相干性，這對于減少圖像中的散斑效應都是非常重要的。對FYLA白色激光選擇500至700nm(140nm FWHM)的波段用于光片熒光顯微鏡，可以提供較低的時間相干性以降低散斑對比度。

圖1：彈性散射光片顯微鏡中偏振和相干控制的實驗裝置示意圖。圖(a)：光片照明光路由一對發射波長分別為515nm和638nm的二極管激光器和一個超連續譜激光器(SCL)組成。激光束在進入顯微鏡之前被放大10倍。P1是一個半波片(HWP)，它在通過柱面透鏡(CL)、振鏡(GM)和照明物鏡(OBJill)之前控制三束光束的偏振。GM掃描OBJill瞳孔處的光束，在樣品平面上產生一個旋轉的光片。樣品保存在裝滿水的定制浸沒室(C)中。檢測系統由一個0.5N.A.物鏡(OBJdet)、一個200mm管透鏡(總放大倍率為20X)和一個偏振器(P2)組成。圖(b)：FYLA激光器在500-700nm(140nmFWHM)波段的發射光譜，紅色垂直波段為紅色二極管激光器的帶寬(1.2nm)。圖(c)：靠近照明物鏡(OBJill)的光學設置的細節，說明了旋轉光片方法。FYLA激光片圍繞位于OBJill工作距離(WD)的軸旋轉，即位于樣品平面的中心

FYLA超連續譜激光是否在LSFM中實現了無標記的結構成像?

以上實驗結果表明，與其他光譜帶寬較窄的光源相比，Iceblink超連續譜光源對LSM圖像的散斑貢獻較低，從而可以總結出彈性散射光片顯微鏡是一種適用于無標記結構成像的新型光片成像方式。為了提高此配置中的成像質量，他們還建議實施：1、偏振控制，可實現對比度選擇性并消除基板背景。2、時間和空間相干性降低，可以從散斑噪聲中提取內源性內在對比度。

以這種方式實施，彈性散射光片成像為標準LSFM實驗提供了有用的補充結構信息，如MCTS樣品所示。此外，它有可能類似于組織切片但以非破壞性方式提供樣品的相關形態學細節。最后，彈性散射光片顯微鏡是一種很有前途的技術，可以進行新的有趣的實驗，例如，在受低信噪比限制的應用中替代LSFM，例如功能成像或快速體積結構成像。

圖2：使用彈性散射光片顯微鏡系統獲得的線蟲頭部圖像。a)使用FYLA光源的蠕蟲頭部3D圖像堆棧的最大強度投影(圖像尺寸為230×110μm)。b)是使用FYLA Iceblink光源獲得的(a)平面之一的細節(圖像為80×40μm)。c)是使用488nmCW二極管激光器獲得的與(b)相同的圖像(圖像為80×40μm)

來源文獻：

Enhanced Light Sheet Elastic Scattering Microscopy by Using a Supercontinuum Laser.

Diego Di Battista, David Merino, Giannis Zacharakis, Pablo Loza-Alvarez and Omar E. Olarte.

關于超連續激光器

超連續譜激光器(Supercontinuum Sources)又稱白光激光器。2000年，RANKA等報道了在光子晶體光纖中產生2倍頻程的超連續譜，超連續譜的產生為非線性光纖光學領域的研究注入了新的活力。利用光子晶體光纖產生超連續譜是一種新型的光源，它具有高的輸出功率、平坦的寬帶光譜、高度的空間相干性(聚焦)等特性，能極大提高信噪比、減小測量時問以及加寬光譜測量范圍。光纖超連續譜光源可應用在光纖衰減測量、干涉測量儀、光相十攝影術、光譜學分析、生物成像、光學頻率梳等領域。

關于Iceblink超連續激光器

Iceblink是一款覆蓋450- 2300nm光譜范圍的超連續光纖激光器，具有超過1W的平均功率和卓越的穩定性(0.5%標準偏差)。它是一種用途廣泛的白光光源，在科學和工業領域有著廣泛的應用，典型應用包括材料表征、VIS、NIR和IR光譜、單分子光譜和熒光激發的吸收/透射測量。 Iceblink的空間相干性和寬光譜范圍使其成為傳統燈源、單波長激光器、LED和ASE光源的絕佳替代品。

圖3：Iceblink超連續激光器實物圖

規格指標：

圖4：Iceblink超連續激光器典型光譜

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審核編輯：湯梓紅