大家好！為大家介紹一篇2022 年發表在Nucleic Acids Research上的文章，題目是“STRIDE: accurately decomposing and integrating spatial transcriptomics using single-cell RNA sequencing”。本文提出了使用一種名為“STRIDE”的解卷積新方法，通過整合scRNA-seq數據和空間轉錄組數據，來解析空間轉錄組的每個spot的細胞類型組成。此外，該模型還可以對不同心臟組織切片進行三維重建，從而形成心臟的三維模型。本文通訊作者為同濟大學的王晨飛教授，研究方向為單細胞及空間多組學生物信息學方法開發。

背景介紹

有研究表明，細胞異質性不僅由其內部調控網絡的影響，還受到其外部微環境的影響。目前，scRNA-seq技術的快速發展使得我們能更好理解細胞內部調節網絡的運轉機制。而在空間轉錄組上，雖然目前已開發了許多的解卷積模型來解析空間轉錄組中spot的細胞類型組成來幫助我們理解細胞外部微環境對細胞基因表達的影響，但現有的解卷積方法都依賴于marker基因，這可能會受到高drop-out率和一些不感興趣基因表達波動的影響。其模型敏感性和特異性不高。因此，迫切需要一種能平衡敏感性和特異性的解卷積模型。

設計思路

在機器學習中，文本挖掘領域的一類最常見的主題模型（topic model）是隱狄利克雷分布，簡稱LDA (Latent Dirichlet allocation)。其目的是為了從文檔中發現潛在的語義結構。而在生物信息學中，大部分需要處理的單細胞基因表達矩陣數據存在稀疏性。又因為主題模型能容忍數據的稀疏性并且具有很好的可解釋性，從而使得可以被應用于處理scRNA-seq數據。

本文開發的解卷積方法STRIDE可以整合利用scRNA-seq數據對空間轉錄組數據每個spot進行細胞類型解析。STRIDE首先使用LDA對帶注釋的scRNA-seq數據進行主題建模，通過variational Bayes (VB)算法求解基因表達-主題分布和主題-細胞分布（即每種細胞類型潛在的基因表達模式）的參數，最后再通過貝葉斯推斷得到細胞類型-主題分布。然后使用細胞類型-主題分布可以將scRNA-seq數據中的每個細胞分配到最可能的細胞類型，從而達到對scRNA-seq數據進行細胞的分解的目的。

在空間轉錄組數據中每個spot的基因表達可以被看作是不同類型的多個細胞的混合物。所以，對于空間轉錄組數據，先根據在scRNA-seq數據中獲得基因-主題分布使用LDA去估計spot-主題分布，而后聯合spot-主題分布和細胞類型-主題分布計算spot屬于每種細胞類型的概率，反過來就可以將這種概率看作每種細胞類型在spot中所占的比例，從而達到對ST數據進行細胞的分解的目的。此外，STRIDE還提供幾個下游分析，包括特征（即主題）檢測和可視化，基于鄰域細胞群的空間聚類和區域識別，空間結構的3D重建。圖1是整個方法的過程以及其下游分析。

圖1 STRIDE工作流程的示意圖

數據介紹

首先，作者從乳腺癌（BRCA）scRNA-seq數據模擬了三個ST數據集，具有已知細胞類型組成的合成混合物可以作為基準，用來測試 STRIDE 在分解細胞類型方面的性能。作者驗證了主題建模發現特定細胞類型主題的能力，得出的28個不同的主題富含不同的細胞類型，GO注釋表明主題與特定細胞類型之間的有效關聯（圖2A）。接著，基于訓練的相同數據集并驗證，STRIDE可實現較高的細胞類型分配準確度（圖2B）。作者將STRIDE模型和其他已發表方法進行比較（圖2D-F），使用了Pearson’correlation系數評估模型預測和真實的一致性，以及計算組內均方根誤差（RMSE）來評價模型的靈敏度和特異性，STRIDE均表現出最佳性能。最后，作者比較不同測序深度下STRIDE的魯棒性，如圖2G所示，STRIDE模型在6類測序深度的數據上預測值和真實值的相關性都是最大的，STRIDE模型的魯棒性高于其它解卷積模型。

圖2.使用模擬數據對STRIDE的性能進行基準測試

為了考察STRIDE模型在真實數據集上的表現。作者將其應用在小鼠小腦ST數據集上。因為小鼠小腦呈現明確定義的細胞類型層結構，因此可用于評估STRIDE模型的細胞類型分解性能。結果如圖3A，這與以前的研究結果（圖3B）一致，兩種類型的分子層中間神經元MLI1和MLI2被映射到小腦皮質的頂層和最外層。伯格曼細胞（bergmann）和普爾基涅細胞(purkinje)共定位于同一中間層—Purkinje層，而顆粒細胞（granule）定位于底層顆粒層—Granule層（圖3C）。少突膠質細胞(oligodendrocytes)和星形膠質細胞(astrocytes)分散在顆粒層下方（圖3D）。

圖3. STRIDE在小鼠小腦的應用

此外，作者還將STRIDE模型應用于人類鱗狀細胞癌微環境中腫瘤細胞研究其異質性。STRIDE計算得到spot的細胞類型比例（圖4A），進一步根據spot細胞類型比例的相似性進行空間聚類（圖4B），共獲得6個簇。其中C4簇和C2簇分別代表著纖維血管生態位和免疫相關前端，而C3簇主要由上皮細胞（epithelial）和惡性細胞（malignant）構成，由此可以將C3簇區域視為腫瘤區域，這與之前的研究結果一致。作者同時探討了免疫細胞亞群分布與腫瘤相對位置之間的關系，表明STRIDE解卷積可以定義空間域，并進一步表征腫瘤微環境中細胞類型的空間分布模式。

由于腫瘤細胞通常表現出高度的異質性，所以作者利用上述的空間域來研究腫瘤細胞異質性與其空間位置之間的潛在關系。作者將C3定義為腫瘤核心區域，C1,C4,C5作為腫瘤邊緣區域（圖4D）。然后分別對兩個區域進行了差異基因表達分析和功能富集分析。結果表明腫瘤核心和腫瘤邊緣區域顯示出不同的hallmark通路。腫瘤核心區的特點是雌激素反應和膽固醇穩態通路的富集，據以前的研究，這在鱗狀細胞癌的發生中起著重要作用。相比之下，邊緣區域特異性基因在干擾素相關的信號通路中高度富集，這與之前研究的結果一致。綜上所述，STRIDE的細胞類型解卷積結果有助于識別空間局部區域。

圖4. 描述人鱗狀細胞癌微環境的異質性

為了驗證STRIDE在不同生物系統中的應用，作者還將其應用于器官發育的空間組織研究。作者收集了6.5–7個孕周心臟的scRNA-seq數據來訓練模型，并對三個發育階段（4.5–5、6.5和9個孕周）的所有樣本進行細胞類型解卷積。結果如圖5A所示，在所有三個階段中心房細胞（atrial）和心室肌細胞（ventricular cardiomyocytes）被預測位于上心室和下心室。心外膜細胞（epicardial）也被正確地映射到心臟的外層，即心外膜(epicardium)。通過STRIDE模型繪制的細胞類型映射與此前通過整合ISS和scRNA-seq生成的空間細胞類型圖高度一致（圖5B）。綜上所述，STRIDE可以推斷不同的時間點的組織細胞類型混合模式。

圖5.STRIDE在發育中的人類心臟上的應用

為了進一步展示STRIDE模型生成主題的應用，作者開始探索利用STRIDE解卷積結果去對多個樣本進行綜合分析。主要思想是根據spot的主題分布特征將相鄰兩張slide上的spot進行配對，即在兩個slide上的具有相似細胞組成的spot進行映射配對。結果如圖6A所示，在心室區域（ventricle）內主要包含心室肌細胞（ventricular cardiomyocytes）的spot之間互相映射，在左心房和右心房中的心房細胞（atrial cardiomyocytes）在局部區域被正確映射。隨后作者將這些slide按順序排序，從而構建了人類心臟的三維模型（圖6B）。使用這種方法對發育中的人類心臟進行三維重建僅需要細胞的空間表達信息即可，不需要基于圖像的配準，由此可見STRIDE模型的應用廣泛。

圖6. 發育中的人體心臟的三維模型重建

總結

作者將機器學習中的主題建模模型應用于整合單細胞數據和空間轉錄組數據來解析空間轉錄組的細胞類型組成，開發了一種高靈敏性和高特異性且魯棒性很好的方法STRIDE。這種方法不僅能夠分析空間轉錄組中spot的細胞類型組成，而且其衍生的主題分布還能夠用于特征（即主題）檢測和可視化，空間聚類和空間域的識別，以及重建心臟的三維模型等。STRIDE利用單細胞數據來解析空間轉錄組數據的細胞類型組成，從而研究細胞外部的微環境對細胞基因表達的影響，為研究細胞的異質性提供了極大的便利。

審核編輯 ：李倩