單細胞中內容物體積少、含量低、種類多、分析窗口有限，使得高靈敏、高信息覆蓋度、快速、高通量的單細胞分析面臨重大挑戰。通過單次測量實現多維度、多參數的單細胞定量信息獲取，對于細胞分型、鑒定以及單細胞水平的疾病相關分子機制研究具有重要意義。單細胞測序技術方興未艾，但針對單細胞中蛋白質和代謝物的分析技術仍非常有限，尤其是大量蛋白質和代謝物的同時分析尚未見報道。熒光流式細胞術可對單細胞中多種蛋白質進行分析，然而光譜帶寬重疊問題限制了其同時測定的通道數。以CyTOF為代表的質譜流式細胞儀可實現單細胞中40余種蛋白質的同時定量分析，但其依賴于ICP-MS儀器，且ICP-MS無法提供細胞內源物質結構信息，極大地限制了方法的檢測對象；有機質譜的結構鑒定能力強、質量分辨率高，可實現單細胞中小分子代謝物的分析。基于有機質譜建立流式細胞分析新方法，從而獲取單細胞中蛋白組、代謝組等多組學信息，在單細胞異質性相關研究具有不可替代的分析優勢。

北京大學劉虎威/白玉課題組于2019年報道的工作利用新型兼具質譜增敏和信號放大策略的質譜探針，構建了常壓質譜免疫分析平臺，實現了zmol的蛋白質檢出限以及最低13個細胞表面3種蛋白質的定量分析（J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 72-75）。最近，研究團隊對質譜探針進行拓展，并利用基于狄恩流的微流控芯片實現單細胞排列，結合納升電噴霧-高分辨質譜（nanoESI-HRMS），搭建了多維度有機質譜流式細胞分析平臺（圖1）。該平臺能夠高通量地對單細胞水平的蛋白質和代謝物等多維度的信息進行同時獲取。相關成果2020年10月21日以“Multi-Dimensional Organic Mass Cytometry: Simultaneous Analysis of Proteins and Metabolites on Single Cells”為題在《Angewandte Chemie International Edition》雜志在線發表。

圖1 多維度有機質譜流式分析平臺

該工作中設計并合成了一系列基于羅丹明質量標簽的質譜探針，對單細胞表面的CA125，CEA，EpCAM，CD24，CD44和CD133等重要的蛋白標志物進行標記；標記的細胞利用基于迪恩流的微芯片實現單細胞排列，并利用nanoESI-HRMS實現單細胞檢測。離子化過程中可實現質量標簽的高效解離和細胞內容物的有效釋放，從而確保了單細胞中蛋白質和代謝物信息的同時獲取。該質譜流式分析平臺成功實現了單細胞水平6種目標蛋白質及84種代謝物的同時檢測，證實了蛋白質和代謝物在細胞個體間的顯著差異性（圖2）。

圖2 A2780細胞質譜流式分析結果

基于該多維度有機質譜流式細胞分析平臺所獲取的信息，工作首次同時利用蛋白質及代謝物信息作為細胞分型依據，在5種腫瘤細胞的PCA分析中獲得了更好的鑒定和分型結果。在利用Ward’s法得到的聚類結果中，相比于利用單一的蛋白質或代謝物信息，使用蛋白質和代謝物的綜合信息能夠獲得更高的分型靈敏度和特異性。單細胞分析方法在干細胞研究、細胞耐藥性研究以及癌癥治療等方面具有重要意義，該流式平臺還成功實現了腫瘤細胞耐藥異質性分析，其結果有望為分子水平的耐藥性細胞研究或癌癥干細胞研究提供分析依據（圖3）。

圖3 細胞分型和腫瘤耐藥差異性結果圖

近幾年來，劉虎威/白玉課題組致力發展基于質譜的復雜生物體系中痕量生物標志物分子的高效、高靈敏和高通量測量新方法和新應用。本工作第一作者為15級博士研究生徐姝婷，白玉副教授為文章的通訊作者。研究工作得到了國家自然科學基金委和科技部國家重點研發計劃和北京市自然科學基金重點項目的資助。上述內容已經申請國際專利PCT（PCT/CN2020/083482）。

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