近日，愛思唯爾（Elsevier）旗下著名分析化學期刊Analytica Chimica Acta（IF：5.977）在線發表了上海交通大學系統生物醫學研究院陶生策團隊的最新研究成果“Multiplex and Visual Detection of African Swine Fever Virus (ASFV) based on Hive-Chip and Direct Loop-mediated Isothermal Amplification”。該研究基于“蜂巢芯片（Hive-Chip）”和“LAMP直擴法”提出了針對非洲豬瘟病毒多基因并行檢測的全流程方案，具有無需核酸提取、不依賴精密儀器及避免因病毒的單個基因突變引起的假陰性問題，且靈敏度高、特異性強、可視化檢測以及適用于POCT（Point of Care Testing，即時檢測/床旁檢測）等優點。本研究也已申請相關專利“一種靶標基因組合在非洲豬瘟病毒檢測中的應用及試劑盒”。

非洲豬瘟 (African swine fever, ASF) 是由非洲豬瘟病毒 (African swine fever virus, ASFV) 引起的豬的一種急性、高度傳染性和致死性的疾病，死亡率高達100%。截止到2020年3月5日，中國已有32個省份共爆發165起非瘟疫情，累計撲殺生豬1,193,000頭，給中國乃至全世界的養豬業帶來巨大的威脅。ASFV是一種呈二十面體對稱的dsDNA病毒，基因組巨大（170~190 kb），由于其復雜的基因組成和高度變異性，已根據同源性較高的編碼衣殼蛋白VP72的基因B646L被劃分為24個基因型。目前，ASF尚無有效的治療方式和疫苗，撲殺和焚燒是防止疫情蔓延最有效的手段，因此快速、準確地檢測ASFV至關重要。

現有ASFV核酸檢測方法主要存在兩個問題：只針對ASFV單基因進行檢測，依賴于復雜精密的儀器。針對問題一，本研究首先根據ASFV序列比對結果獲得了較保守的5個基因（B646L、B962L、C717R、D1133L、G1340L），并針對每個基因設計4套LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，環介導等溫擴增）引物，通過In-tube LAMP和On-Chip LAMP進行了有效性（Validity）、特異性（Specificity）和靈敏度（Sensitivity）測試，得到了一組能夠用于ASFV多基因檢測的LAMP引物，有效避免因單個基因突變而造成的假陰性結果，提高陽性檢出率；針對問題二，本研究采用物理隔離的策略，將10根毛細管通過PDMS（聚二甲基硅氧烷）基座集成起來形成酷似蜂窩煤的“蜂巢芯片”，并進行疏水修飾。每根毛細管內固定不同基因所對應的LAMP引物，借助加樣接頭（Adaptor）和毛細現象，使樣本同時分散到各個毛細管內，進行等溫擴增和熒光檢測，實現了一次反應同時檢測多個基因，并且LAMP直擴法免去了核酸提取步驟。

基于此，團隊成員分別對豬血模擬樣本和ASFV基因組DNA樣本成功進行了檢測，并以其他豬病毒基因組DNA樣本（包括豬偽狂犬病病毒PRV、豬圓環病毒2型PCV2以及豬細小病毒PPV）進行了特異性檢測。為了進一步證明ASFV多基因檢測的必要性，團隊成員將現有ASFV菌株（GenBank: EF121429.1, MH025920.1, KM111295.1，MH025919.1）存在的點突變引入B646L基因質粒中，芯片檢測結果發現該位點（即1號毛細管）呈陰性，而其他毛細管呈陽性，表明如果此時只檢測B646L基因，就會出現假陰性結果。

綜上，本研究針對ASFV開發了通用的多重核酸檢測平臺，特別是針對易變的病原體（例如新冠病毒），通過一次反應檢測多個基因，既能實現多重可視化檢測，又不依賴精密儀器和專業操作，適合口岸檢驗檢疫和現場即時檢測。

本研究的第一作者為上海交通大學2017級博士研究生朱元首，通訊作者為上海交通大學陶生策研究員和北京博奧生物張巖博士。

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