近日，武漢科技大學醫學院公共衛生學院李誠予副教授在CRISPR/Cas12a生物傳感器的構建方面取得階段性進展，研究成果“A boosting upconversion luminescent resonance energy transfer and biomimetic periodic chip integrated CRISPR/Cas12a biosensor for functional DNA regulated transduction of non-nucleic acid target”發表于SCI一區期刊《Biosensors and Bioelectronics》上。

近年來，基于Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) 的基因編輯技術受到了科學界的廣泛關注。這項革命性技術的靈感是來源于細菌和病毒在生命進化歷史上進行斗爭所產生的免疫應答模式。簡單來說，就是病毒能把自己的基因整合到細菌內，利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務，而細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR系統。利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的基因組上切除。

由于CRISPR系統需要核酸酶（Cas蛋白）結合一段引導RNA（CrRNA）來實現目標核酸的特異性識別，因此該技術在實際操作過程中具有很高的精準度。相比于早期發現的CRISPR/Cas9系統，近年來新發現的CRISPR/Cas12a系統不僅具備CRISPR/Cas9的cis cleavage功能，還可實現一種特殊的trans cleavage效應，即額外對任意“非目標”核酸序列進行切割。

近期，借助CRISPR/Cas12a優異的目標物識別精準度以及trans cleavage能力，研究人員基于電化學、比色、熒光等分析平臺構建了一系列的生物傳感器，其中熒光分析受到更為廣泛的關注。但是，由于缺少有效的目標物轉導模式，目前所報道的CRISPR/Cas12a傳感器都只能用于單純核酸的檢測。為進一步擴大分析物的范圍，李誠予副教授在本工作中將“功能化DNA”這一概念引入CRISPR/Cas12a系統以實現對非核酸目標物的轉導。通過將適配體和DNAzyme作為功能化DNA，上述CRISPR/Cas12a傳感器可有效對模型目標物ATP和Na+分別進行信號轉導。

由于目前所構建的CRISPR/Cas12a熒光生物傳感器都是基于傳統的斯托克斯熒光發射模式（可見光激發），因此它們在復雜生物樣本（如細胞提取液，人體體液）中仍存在挑戰。為解決這一問題，李誠予副教授將“基于上轉換發光的發光共振能量轉移（LRET）”這一檢測模式進一步引入到CRISPR/Cas12a系統中。由于上轉換納米顆粒（UCNP）的尺寸較大（一般> 20 nm）, 將UCNP作為能量供體的LRET體系存在能量轉移效率很低（一般< 50%）這一瓶頸。李誠予副教授在本工作中構建了一種“能量集中”型UCNP，即通過構建一種“三明治”結構的UCNP，將上轉換發光區域極大地局限于一個很窄的內殼層內（~ 2.5 nm）。基于以上設計理念，上述改進的UCNP對其表面所偶聯的報道DNA（修飾有BHQ-1分子）的能量轉移效率可被顯著提升至92.9%。

“能量集中”型UCNP與仿生周期芯片相結合的針對非核酸目標物的CRISPR/Cas12a生物傳感器原理圖

為進一步提升分析靈敏度并同時實現“即使檢測”，李誠予隨后將上述傳感體系負載于一種特殊的“仿生”周期芯片當中。通過選用光子晶體作為信號放大器與芯片界面，上述上轉換發光強度可被大幅提升35倍。同時，該傳感器可在便攜式手持980 nm激光器的照射下，通過手機拍照這一簡單的方式來進行定量檢測，對ATP和Na+的檢出限可分別低至18 nM和0.37 μM，并具有很好的特異性。此外，該方法不僅可有效對單細胞水平內的ATP含量變化進行動態監測，還可準確分析低血鈉患者中的血漿鈉含量。

上述論文武漢科技大學為第一完成單位，李誠予副教授為第一作者兼通訊作者，武漢大學唐宏武教授為共同通訊作者，武漢大學鄭貝博士為共同第一作者。該工作得到國家自然科學基金（21904102, 81772256和21827808）的支持。

原文標題：武漢科技大學構建新型CRISPR/Cas12a生物傳感器，幫助實現非核酸目標物的轉導

文章出處：【微信公眾號：微流控】歡迎添加關注！文章轉載請注明出處。

責任編輯：haq