GeIMA生物墨水打印的耳朵

GeIMA生物墨水打印的器官

生物3D打印，就如同切土豆的逆過程，即將土豆片、土豆絲、土豆丁及土豆泥反向組裝成土豆。然而，組裝出的土豆內的細胞雖然有很好的活性，但這樣的土豆種到地里卻很難直接發芽（打印出的器官與體內器官從功能上來說還有較大的差距），這種“形似而神不似”的問題正是當下生物3D打印面臨的瓶頸之一。

據記者了解，要想打印出既在外形結構上相似，結構內的細胞又具有協同功能的組織器官并非易事。這不僅需要開發合適的活性“生物墨水”，還需要一臺能夠精準操控的3D打印設備。

近日，浙江大學機械工程學院教授賀永帶領的課題組發明了一種新型生物3D打印方法，該方法能夠操控細胞形成特定結構的微球或微纖維，進而長成具有生物活性的微組織。相關論文先后刊登在SMALL雜志上。

不過，賀永對《中國科學報》記者坦言，很多人認為生物3D打印已經無所不能，甚至覺得很快就可打印心肝腎肺等器官，實現器官移植，然而，事實上生物3D打印還遠未達到我們最初器官打印的設想，體外打印能夠用于移植的活性器官還有相當長的路要走。目前的生物3D打印，有兩個重要應用，其一是構造人體器官模型，從而為疾病機理研究、腫瘤的個性化治療等提供更為高效的手段；其二是為器官/組織的局部缺損、功能喪失等提供更高效的修復手段。

為體外重建器官提供新思路

生物3D打印也叫細胞打印，是指操縱細胞“生物墨水”構造活性結構的過程，而開發合適的生物墨水一直是生物3D打印中的一個核心問題。

賀永告訴記者，“生物墨水”首先要具備非常好的生物活性、類似體內的細胞外基質環境，便于打印后的細胞進一步發育，并建立細胞彼此間的通信。另外，在打印過程中還要求“生物墨水”必須具有很好的流動性，打印后能很快固化以便于固定成型。

甲基丙烯酸化水凝膠（GelMA）就是一種光敏性生物水凝膠，兼備較強的可加工性和生物相容性，是組織工程、生物醫學、生物制造等領域的熱門材料。不過，GelMA的固化時間稍長（約3~5秒），同時載細胞的GelMA黏度較低，導致其直接制造難度較大。賀永教授課題組多年從事生物3D打印研究，已成功實現GelMA“生物墨水”及生物3D打印機的產業化。

“如果能高效實現GelMA微纖維的制造，就有望發展出基于微纖維的迷你組織。”受到旋繩效應的啟發，賀永課題組開發出了一種同軸生物打印技術。通過該技術，賀永課題組打印出包裹人臍帶靜脈內皮細胞的直血管和螺旋血管迷你組織，細胞在GelMA里可以增殖伸展并遷移。有趣的是，隨著培養時間的加長，內皮細胞還遷移到了GelMA纖維外壁，并建立連接形成類似血管的內皮管腔。

此外，賀永課題組還致力于構建基于微球的迷你組織，他們將不同的細胞制成“生物墨水”，在一個微流控芯片噴頭的控制下，一點點“吐”出“墨水”。“在一股微氣流的吹動下，噴頭吐出的液滴不會馬上落下，而是旋轉起來，此時再根據數學建模控制不同組分‘生物墨水’下降的方向，就能形成精致的立體結構。”賀永說，“這個過程有點像在轉動的蛋糕模具上裱花，讓不同細胞形成特定的立體‘編隊’。”賀永課題組用兩種分別混合了骨髓間充質干細胞和人臍帶靜脈內皮細胞的“生物墨水”，同步打印出了螺旋形的微球，經過幾天實驗室培養便形成了骨類器官。不僅如此，他們還在微球內制造出螺旋面、玫瑰花、太極等復雜三維結構。

“這一技術的精度可以達到單細胞分辨率。”賀永說，與現有生物制造方法相比，其特點是實現了在微小空間內三維結構的可控成型，為體外重建類器官、開發更為高效的器官芯片、實施更有效的細胞治療等，提供有效路徑。

主攻解決“神似”問題

目前，生物3D技術已經從傳統僅注重結構和形狀的制造，拓展到構建體外細胞結構體和生物裝置，并應用于再生醫學、病理學、藥理學和藥物檢測模型，以及基于細胞和微流體裝置的細胞、組織、器官等高級生物和醫療器械產品。

此前在2018中國增材制造大會上，清華大學生物制造中心主任孫偉對《中國科學報》記者表示，細胞打印最關注三個問題：第一能不能打印；第二打印后能不能成型，不能形成孔結構就沒有辦法把營養液放進去，打印結構內部細胞就會死；第三把細胞活著打印出來之后，細胞能不能具有功能。

“生物3D打印的關鍵就是要注意選擇什么樣的噴頭、材料、黏稠度，才能使得這個細胞打出來后，至少保證90%以上的成活率。”孫偉說，他們課題組就利用明膠和海藻酸鈉組合成“生物墨水”進行打印，這種“生物墨水”具有可以隨溫度而變化的趨勢，能夠通過調控溫度使得“生物墨水”在打印時延遲性最小。

實際上，清華大學從上世紀90年代末就開始從事生物3D打印的研究，清華大學生物制造中心教授徐弢還將生物3D打印應用在了神經科學領域。在生物3D打印神經鞘管方面，他們團隊利用制造學的優勢，通過打印微孔多通道結構的神經導管，在早期進行神經生長因子灌注。植入3個月后發現，與未灌注神經生長因子的神經導管相比，灌注有神經生長因子的神經導管具有更好的促進組織再生的能力。

為了使得生物3D 打印的成果更加仿生，徐弢團隊還采用了“同軸打印+納米膜制造神經纖維束”的方法，把神經干細胞做成像線一樣的細胞線，線的中心是神經干細胞，周圍包裹著的則是神經的支撐細胞，這些細胞不斷地產生著營養因子。

“同軸打印的方式，即在中心打印神經干細胞，在周邊打印支撐細胞，最終以條索狀的形式打印出來，然后將條索包裹起來。”徐弢表示，通過實驗發現，這種狀態下纖維束細胞的存活率相當高，而且也在一定程度上釋放出了神經生長因子。

在賀永看來，生物3D打印的發展就是要解決“形似而神不似”的問題，實現生物3D打印的功能化突破和應用。打印結構后續的功能化是評價打印性能的金標準，也是生物3D打印的最終目的。

解決器官移植仍需時日

賀永告訴記者，細胞被水凝膠包裹的狀態，就如同果凍里面有一堆的水果丁，打印過程中，如果機械力、溫度等工藝控制不好，都會對細胞造成損傷。不過，目前生物3D打印的工藝已經非常穩定，細胞存活率基本都可以達到90%以上。

不過，他也同時指出，生物3D打印目前還只能打印一些比較簡單的組織，比如皮膚、血管等，要想實現打印出的肝臟等復雜器官同樣“神似”，實現復雜器官的全功能重建，至少還需要數十年的時間。

北京大學第三醫院教授余家闊也表示，雖然2015年3D打印的腎臟組織成功問世，但也僅是供醫學研究使用，不能真正應用于器官移植，因為其安全性和實用性還有待探究，3D打印的器官在植入人體前還需經過大量的實驗與數據分析。

余家闊認為，3D打印器官存在的困難主要包括打印材料以及細胞太過微小與脆弱，以及植入人體后能否自然銜接融合同時不產生排異反應。他覺得，未來3D打印器官的趨勢將是以可吸收性生物材料作為載體、以細胞培養為基礎，在體外構成組織保護細胞。對于人體器官也將在研究其營養供應與代謝的基礎上，解決經3D打印技術培養出的組織體植入問題。

徐弢則表示，未來生物3D打印技術發展的機會越來越多，只有更多地與醫療、臨床和基礎科學相結合，才能形成多贏的局面。