自Ash和Knoll等創立表面等離子體共振成像( Surface Plasmon Resonance Imaging, SPR I)技術以來, 使得生物分子點陣的無標記并行檢測成為可能. 迄今為止, SPR I主要采用單波長激發光源, 檢測到的是單色或黑白圖像. 雖然利用多波長激發光源進行SPR I研究具有許多優勢(比如彩色圖像鮮艷動人及信息含量高等) , 并在金屬膜等研究中有所應用, 但在分子類樣品中的研究應用的報道則很少, 原因可能在于沒有商品儀器且彩色信號復雜、分析難度大等方面. 為了探索其中的問題,并促進SPR I新方法的建立和發展, 我們自主設計并建立了彩色表面等離子共振成像(Color SPR I,CSPR I)實驗系統, 并結合利用自己編制的軟件開展了相關研究, 成功地觀測到溶液和蛋白點陣的彩色圖像. 這些結果顯示, CSPR I有可能成為生物分子微點陣(或生物芯片)的一種新型的彩色顯示手段.

1實驗部分

1. 1試劑與儀器

巰基十一酸(Mercap toundecanoic acid, MUA)購自Aldrich公司(Milwaukee, USA) ;氮2羥基琥珀酰亞胺(N 2Hydroxysuccinimide, NHS)購自Acros公司(New Jersey, USA) ; 氮2乙基2氮′2 (二甲氨丙基) 碳二亞胺[ N 2Ethyl2N′2 ( dimethyaminop ropyl) carbodiimide, EDC ]購自Avocado ResearchChemicals Ltd. (Lancashire, UK) ; 牛血清白蛋白(BSA)購自北京拜爾迪生物技術有限公司; 乙醇胺、無水乙醇及其它分析純試劑均購自北京化學試劑公司; 實驗用水為3次蒸餾水; 金膜采用真空噴鍍法在玻璃基底(折射率n = 11516)上鍍制而成, 膜厚約50 nm.

自行研制的CSPR I儀器的示意圖見圖1, 其中的光源是鹵鎢燈, 它所發出的復色光經過透鏡和偏振片后, 擴展成一束平行偏振入射光; 核心分析單元由玻璃棱鏡(折射率n = 11516) 、金膜和樣品池組成, 整體固定在一個能精密調節入射光在棱鏡底部的入射角度的旋轉臺上; 金膜通過香柏油( n =1151)粘接在棱鏡底部, 鍍金面朝向樣品池, 金膜和樣品池體之間用密封墊密封. 信號檢測部分包括彩色CCD (WAT2231S,日本Watec公司) 、焦平面調節透鏡和圖像采集卡(OK_C30A, 北京嘉恒中自圖像技術有限公司). 圖像由微機記錄并顯示.

SPR儀器: 波長詢測SPR光譜儀也由本實驗室設計構建.

1. 2實驗過程

成像實驗基本操作: 當入射光從棱鏡的一側導入照射在棱鏡底部的金膜背面時, 調節旋轉平臺, 使入射光滿足反射條件以形成共振吸收; 將待測樣品導入樣品池, 進而微調入射光角度, 使所記錄圖像最清晰. 把檢測到的圖像信號儲存,以待后續分析.

樣品測定: 將樣品溶液直接注入到樣品池中或使其流過金膜表面, 調節入射角, 實時記錄圖像.

微點陣樣品測定: 以BSA樣品為例敘述. (1) 將BSA溶解在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH =714)中, 配制成015 mg/mL溶液; (2) 在金膜表面自組裝一層MUA膜, 然后將其浸入NHS和EDC的混合液中, 使MUA末端的羧基活化; (3) 采用實驗室自制的點樣儀, 把BSA溶液直接點在經修飾后的金膜表面上, 由于BSA末端氨基與金膜表面活化的酯基發生氨基偶聯反應而形成鍵合微點陣;(4) 用鹽酸乙醇胺溶液浸泡傳感膜, 以封閉微點陣周圍背景處未發生偶聯反應的酯基; (5) 依次用磷酸鹽緩沖溶液和水清洗傳感膜表面, 除去非鍵合吸附的BSA和乙醇胺, 最后用N2 氣吹干, 將其安裝在CSPR I儀上, 調節入射角, 實時記錄圖像.

SPR吸收光譜測定: 把金膜安裝在SPR光譜儀上, 調整入射角, 以空氣譜作參比光譜, 將樣品溶液泵入樣品池, 實時記錄SPR光譜.

2結果與討論

2. 1溶液的表面等離子體共振吸收彩色

利用CSPR I系統考察了一些純溶液樣品的彩色成像. 圖2顯示的是水和乙醇在不同入射光角下測得的圖像色彩, 可見有非常明顯的區別. 該信號提示, 利用CSPR I技術可以根據顏色的不同和變化, 對樣品進行直觀的鑒別.

2. 2彩色成像分析

CSPR I圖像的色彩源于表面等離子體共振吸收, 對應于吸收波長的互補色 .

圖3顯示了乙醇和水的SPR共振波長隨入射角的變化, 比較圖2和圖3可見, 隨著樣品的折射率和入射角的不同, 吸收波長會發生改變, 因而圖像的顏色會發生相應的變化. 比如, 在入射角等于74. 86°時, 乙醇的吸收波長是658 nm, 故顯深綠色, 而水的吸收波長為603 nm, 故顯藍色. 又如當入射角為77. 71°時, 乙醇和水的共振波長分別移至621 和583 nm, 其圖像色彩也相應地變為綠藍色和紫色.

2. 3蛋白點陣的彩色成像

通過溶液的彩色成像實驗可見, CSPR I可被用于樣品微點陣的彩色成像研究和顯示. 為此, 以BSA為對象進行了研究, 結果如圖4所示. 很明顯, 樣點與背景的顏色顯著不同, 由此可以非常直觀地判別出金膜上鍵合的蛋白樣點. 與水和乙醇的實驗類似, BSA點陣的色彩隨著入射角的改變而變化. 結果表明, CSPR I不僅可用于各種溶液的成像研究, 也可用于樣品點陣的直觀鑒別研究. 如果結合分子識別探針陣列, 有可能將CSPR I開發成一種全新的彩色圖像分析方法, 成為一種類似于DNA芯片的彩色分析新方法. 對此有待深入研究.