圖 1：Coherent Axon 780 飛秒激光器

Becker & Hickl GmbH 是光子計數設備的技術領導者，早些時候已經表明，小型飛秒光纖激光器可用作多光子熒光成像系統的廉價激發源。激光器的發射波長為 780 nm，脈沖頻率為 40 MHz 至 80 MHz，平均功率為 100 mW 至 500 mW，不僅適用于激發 NAD(P)H，還適用于各種其他熒光團，包括熒光壽命極短的熒光團。

因此，Becker & Hickl 有興趣了解 Axon 飛秒光纖激光器在這些應用中的性能。

“我們已經證明，相干公司 Axon 780 飛秒光纖激光器與 bh 的精確掃描儀光學元件器件、探測器、TCSPC / FLIM 電子器件和數據分析軟件相結合，可提供有關活細胞和組織代謝的準確信息。”– Wolfgang Becker，德國柏林 Becker & Hickl GmbH 總經理

系統架構

作為測試系統，他們使用 bh DCS-120 MP 多光子 FLIM 系統。該系統的架構如圖 2 所示。

圖 2：多光子激光掃描 FLIM 系統原理

Axon 780 激光器的激光器激光束通過自由光束注入 DCS-120 掃描頭。在掃描頭內部，它被兩個快速振鏡偏轉。掃描頭的掃描透鏡將激光束投射到顯微鏡中。在顯微鏡內部，光束穿過二向色分束器，并投影到顯微鏡透鏡的后孔上。顯微鏡物透鏡將光束聚焦到樣品內部的圖像平面中。當光束被振鏡偏轉時，激光激光器聚焦光柵掃描會在樣品中的圖像區域上方進行。

為了獲得最大的空間分辨率，激光束必須完全填充顯微鏡透鏡的后孔徑。對于掃描和管透鏡的通常焦距，情況并非自動發生。因此，光束在進入掃描儀之前會擴展 1.5 倍。后孔中的光束直徑約為 12 mm，這足以填充即使是最大的顯微鏡透鏡的孔徑。過度填充微孔是沒有問題的。激發功率的相關損失是可以容忍的，因為激光器提供的功率遠遠超過所需的功率。

從樣品中收集熒光，通過顯微鏡透鏡返回，然后通過非去掃描光束路徑饋送。L1 和 L2 形成望遠鏡。望遠鏡還收集顯微鏡透鏡未完全準直的光子，例如散射在厚樣品之外的光子。熒光被分成兩個波長間隔，并通過兩個 bh HPM-100-40 混合檢測器進行檢測。檢測器的單光子脈沖記錄在兩個 SPC-180N TCSPC / FLIM 模塊中。SPC-180N 模塊確定激發脈沖后光子的檢測時間和掃描儀在光子檢測時的位置。此信息用于構建 FLIM 圖像。這些是像素陣列，每個像素在大量時間通道中都包含完整的熒光衰減曲線。

反激相位激光束和光束消隱的掃描由 bh GVD-140 掃描控制器卡進行硬件控制。激光強度控制通過 Axon 激光器的 AOM 控制信號輸入執行。該信號也由 GVD-140 卡提供。整個系統由 bh 的 SPCM 數據采集和控制軟件運行，提供具有掃描儀控制、激光器控制、數據采集和數據分析功能的完全集成 FLIM 系統。FLIM 系統的用戶界面如圖 3 所示。

圖 3：SPCM 數據采集和控制軟件的主面板

結果

使用 DCS-120-AXON 組合拍攝的 FLIM 圖像如圖 4 至圖 6 所示。所有圖像均使用 40x，NA= 1.3 的油浸透鏡。使用 bh SPCImage NG FLIM 數據分析套件進行數據分析。圖 4 和圖 5 顯示了平均(振幅加權)壽命和代謝指標 a1 的顏色編碼 FLIM 圖像。右上方顯示了所選圖像參數(tm 或 a1)的直方圖，右下方顯示了光標位置的衰減曲線。所選光斑的衰減參數顯示得非常右。

圖 4：豬皮、NADH 圖像、雙指數衰減的振幅加權平均壽命

圖 5：豬皮、NADH 圖像、振幅、a1、快速衰變成分。a1 是代謝狀態的指標

圖 6 顯示了酵母細胞。選擇發射濾光片來檢測 440 至 470 nm，從而將光譜范圍限制為檢測 NAD(P)H。 470 nm 的檢測上限可能看起來非常嚴格。但是，為了避免檢測 FAD 和 FMN 熒光，必須限制在 470 nm 以下。這些化合物與 NAD(P)H 一起被激發，但對代謝狀態表現出不同的依賴性。數據通過 SPCImage NG 的 MLE 算法進行分析，在圖像的各個像素中提供高精度雙指數衰減參數。所示圖像顯示 a1，即快速衰減分量的振幅。它表示未結合 NAD(P)H 的數量。 由于結合/游離比隨代謝而變化，a1 也稱為“代謝指標”。

可以看出，a1 在不同細胞中明顯不同。這表明不同細胞中的代謝狀態不同。高 a1(顯示為藍色)表示新陳代謝更糖酵解，低 a1(黃色)表示更氧化。

圖 6：酵母細胞、NADH 圖像、振幅、a1、快速衰變組分、代謝狀態指標

“我們已經證明，相干公司 Axon 780 飛秒光纖激光器與 bh 的精確掃描儀光學元件器件、探測器、TCSPC / FLIM 電子器件和數據分析軟件相結合，可提供有關活細胞和組織代謝的準確信息。” 憑借其基于 AOM 的內部強度控制，激光器可以順利集成到 bh 的 SPCM FLIM 采集軟件中。在光束停止情況和掃描儀反激階段以及可重現的強度控制下，光束消隱可保護樣品免受局部光損傷。總而言之，DCS-120 MP / Axon 780 組合是一種易于使用的高分辨率、高靈敏度雙光子激光掃描 FLIM 顯微鏡。


審核編輯 黃宇