近年來，大量研究致力于開發DNA甲基化檢測方法。檢測方法的進步可以促進DNA甲基化在臨床醫學和科學研究方面的應用。微流控芯片能提供反應所需的條件和環境，可以被視作載體。微流控芯片上的分子分析由于其便攜性、高通量、低成本和高效率的優點而受到廣泛關注。近年來，科研人員開發出多種新型微流控芯片用于DNA甲基化分析并顯示出明顯優于傳統方法的優勢。

近期，來自天津大學精密測試技術及儀器全國重點實驗室的研究人員在Nanotechnology and Precision Engineering期刊上發表題為“Advances in microfluidic-based DNA methylation analysis”的綜述性文章，討論了基于微流控技術的DNA甲基化檢測方法，并描述了近年來取得的巨大進展。最后，研究人員總結了基于微流控技術的DNA甲基化分析方法的優勢及其面臨的挑戰和前景。

DNA甲基化及其檢測

DNA分子是細胞中遺傳信息的載體分子之一，具有遺傳效應的DNA分子被稱為基因。經典的孟德爾遺傳定律能較好地解釋很多的遺傳學現象。然而，經典的遺傳學理論并不完備，能影響生命活動的遺傳因素眾多。隨著多年來大量研究的不斷深入，研究者們對遺傳學有了越來越豐富的認知。

表觀遺傳學是遺傳學的一個分支，主要研究在原始DNA序列沒有改變的情況下發生的基因表達可遺傳的變異。大量的研究表明，表觀遺傳與發育、衰老、疾病等生命過程相關。共價組蛋白修飾和DNA甲基化是表觀遺傳現象中被關注最多的分支。表觀遺傳修飾對染色質結構、基因表達、DNA和蛋白質相互作用、X染色體沉默和基因組印跡等方面均有著影響。

DNA甲基化作為表觀遺傳的現象之一，影響著遺傳物質的表達。在真核細胞中，其一般發生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上。CpG二核苷酸在蛋白質編碼基因的啟動子和第一外顯子中的分布相對廣泛，說明這種分布并非隨機。CpG二核苷酸含量相對較高的區域稱為CpG島：大多數的蛋白質編碼基因在啟動子區域含有CpG島，且其甲基化程度通常與基因的轉錄狀態呈負相關。DNA甲基化在不同細胞、組織或個體間有著一定程度的差異。圖1展示了一種基因表達調控的機制，涉及多種相互作用。DNMT蛋白可以主動改變DNA的甲基化狀態，Tet蛋白也被發現對DNA甲基化具有調節作用。甲基化CpG可以通過甲基CpG結合域（MBD）蛋白來確定。結合后，組蛋白脫乙酰酶（HDAC）可以修飾到組蛋白尾部，從而去除乙酰化（AC）。在上述過程之后，染色質被壓縮并且基因表達被抑制。甲基化修飾在染色質狀態的調節中起著重要作用。



圖1 DNA甲基化對基因表達的影響

DNA甲基化（如抑癌基因啟動子CpG島的高甲基化）被發現與癌癥有很強的關系。許多的DNA甲基化的變化被證明與某種癌癥的發生有著特異性的關聯，并且在早期就能被檢測到。一些研究證明了伴隨癌癥發生的基因組整體甲基化程度降低。而且不同種類的癌癥有著各自特異性的甲基化修飾特征。該綜述也提到了能同時篩查多種癌癥的研究工作。因而胞嘧啶的甲基化修飾擁有著被用作癌癥篩查或診療的標志物的極大的潛力。

一方面，由于缺乏大規模的驗證和比較，DNA甲基化作為臨床醫學中疾病診療的依據仍然受到限制。另一方面，DNA甲基化在空間上的和時間上的異質性對檢測手段提出了很高的要求。雖然已經開發出了不同的檢測方法，但是現有的方法仍然存在不足，這很大程度上限制了甲基化檢測被應用于臨床醫療。因此，近些年來大量的研究聚焦在DNA甲基化的檢測方法上。

已經開發出多種極具潛力的方法來檢測甲基胞嘧啶，以滿足不同情況下的檢測要求，圖2列出了一個較為典型的DNA甲基化檢測流程。這些方法在靈敏度、成本、定量能力、分辨率、掃描范圍和響應時間方面差異很大。而且，受制于工作流程的復雜性以及已經發現的與癌癥的特定關系不足等因素，DNA甲基化在臨床上的應用并沒有達到預期。因此，DNA甲基化檢測手段是一個關鍵因素。很多的研究聚焦在開發更為簡便高效、低成本、高通量、高靈敏度的檢測方法上。

圖2 典型DNA甲基化分析的工作流程

基于微流控芯片的檢測方法

DNA甲基化分析在臨床醫學和科學研究中的應用沒有達到最初的預期，部分原因是分析方法的復雜性、成本、通量和效率。為了促進對DNA甲基化的理解，研究人員做出了多方面的努力。已經開發并報道了新的方法，近年來，基于微流控技術的分析優勢逐漸凸顯。微流控芯片方法被認為是有前景的，有望促進DNA甲基化分析的更多應用。目前已有的方法主要集中在樣本前處理微流控芯片、產物檢測微流控芯片、片上實驗室等幾個方面。微流控芯片可以被開發用于樣本亞硫酸氫鹽轉化、核酸提取、目標細胞篩選富集。另外，在產物檢測方面，微流控芯片可以結合電泳、表面等離子體共振、特異性擴增、數字式擴增、免疫分析等檢測方法，可以實現高通量且低成本的檢測。一種在微流控芯片上進行的數字式擴增和檢測用于DNA甲基化分析的方法被認為是極具應用潛力的。研究人員已經設計、制造并驗證了微陣列芯片，以并行地對每個目標分子進行分析。含有不同甲基化DNA的樣品用亞硫酸氫鹽試劑處理并純化。制備后，將PCR混合物驅動到微腔中，并通過油分散以產生均勻的反應，從而可以數字詢問甲基化狀態。根據高分辨率熔體（HRM）分析的原理，超甲基化模板在轉化和擴增后將表現出更高的熔融溫度。甲基化狀態是通過詢問熔化溫度來判斷的。超低檢測限已在該平臺上得到確認，這說明了基于數字熔化的DNA甲基化分析的優勢。

通過微流控技術可以實現高度集成的檢測。芯片實驗室或微全分析系統具有多種優點。可以在芯片實驗室系統上以快速簡單的方式進行各種臨床或生化臨床測試。在芯片上進行DNA甲基化分析的整個過程是一個非常有吸引力的前景。已經有很多相關研究致力于開發用于檢測DNA甲基化的微流控芯片。

基于微流控芯片實現樣本前處理

亞硫酸氫鹽可用于將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不會受到影響。經過亞硫酸氫鹽處理的甲基化胞嘧啶和非甲基化胞胞嘧啶在PCR擴增或測序中表現不同。胞嘧啶的甲基化修飾可以通過對比亞硫酸氫鹽處理前后的序列來確定。然而，基于亞硫酸氫鹽的分析的局限性之一是亞硫酸氫鹽轉化的復雜性。此外，在處理過程中，樣品反復暴露在環境中并在容器之間轉移，這可能導致污染和樣品損失。亞硫酸氫鹽轉化過程中引入的污染和樣品損失可能導致假陽性（陰性）、有偏差的定量或擴增抑制。為了解決這個問題，微流控芯片可以作為亞硫酸氫鹽轉化的優良載體。

MBD蛋白可以修飾到表面上以捕獲目標分子，這很容易通過微流控技術實現。另外還可以從細胞篩選的角度促進DNA甲基化分析。靶細胞的選擇和分離可以通過親和富集來實現，可用于下游甲基化分析。當流體流過芯片時，目標細胞被捕獲，從而實現富集。目標細胞可以被圖案化在器件上的微結構捕獲，因為它們與其他細胞具有不同的尺寸。該研究豐富了微流控技術在DNA甲基化分析中的應用，該設備與多個下游分析相匹配。需要進一步探索其與不同分析方法的耦合。

基于微流控芯片實現數字式檢測

大多數方法的定量能力不足，也缺乏檢測稀有DNA甲基化修飾的能力。異常的DNA甲基化是癌變組織中常見的表觀遺傳改變。然而，異常甲基化在正常組織中也可能較少出現，這有可能被用作癌癥風險標志物。局限性在于正常組織中稀有甲基化的檢測和精確定量可能超過傳統的定量PCR的能力。數字PCR（Digital PCR，dPCR）技術在1999年被Vogelstein和Kinzler提出，被認為是第三代PCR技術。對于上述問題，基于數字PCR的DNA甲基化檢測得到了極具競爭力的結果，而絕大多數的數字PCR方法都是基于微流控技術實現的。DNA甲基化檢測被進一步地開發出了數字化的形式。稀有的甲基化等位基因可以被成功檢測到并實現絕對定量。這種方法的意義在于它擁有檢測到正常組織中的稀有的甲基化修飾的能力。如圖3所示，微流控芯片可以以不同的方法幫助形成大量相互獨立且穩定的液滴，包括大量微腔、油水相互作用等方法，這是微流控芯片的優勢所在。



圖3 基于數字熔解分析的DNA甲基化分析

基于微流控芯片實現“樣本進-結果出”檢測

研究人員致力于開發高度集成的檢測方法，微流控技術提供了一條途徑。具有多方面優勢的芯片實驗室或微全分析系統的檢測模式可以以快速和簡單的方式在芯片實驗室系統上進行各種臨床或生化臨床測試。如圖4所示，這種檢測模式可以允許包括樣本預處理在內的所有的檢測步驟都在芯片上執行，無需過多的人為操作和干預。在芯片上進行DNA甲基化分析的整個過程具有重要意義。盡管芯片可以實現“樣本輸入-結果輸出”檢測，但目前已有的方法只能實現單次處理一個樣本。

圖4 “樣本進-結果出”DNA甲基化檢測微流控芯片

微流控芯片的優勢

本文介紹并討論了基于微流控的DNA甲基化分析的最新進展。近年來，DNA甲基化引起了人們越來越多的關注，微流控技術已經應用于DNA甲基化的一些研究中。許多傳統方法已經在微流控芯片上實現。比較目前已報道的多種基于微流控芯片的DNA甲基化檢測可以發現一些值得關注的特點。微流控芯片作為DNA甲基化檢測的很好的載體，能較好地減少外部干擾，防止污染等因素對檢測結果造成影響。盡管基于數字PCR的DNA甲基化分析的復雜性較為明顯，但其高靈敏度是不可否認的，因此嘗試開發更為簡便高效的方法是有意義的。不同微流控器件之間的差異性較大，具體表現在靈敏度、定量能力、成本、檢測限、響應時間等方面，而且在用途上也表現出了多樣性，如用于樣本前處理的微流控器件、基于不同檢測原理的微流控器件、用于芯片實驗室的微流控器件等。

圖5 DNA甲基化檢測方法

可以通過使用基于微流控的方法而不是傳統的方法來減少分析所需的時間。多項研究利用微流控技術實現了DNA甲基化的快速分析。其次，通過創建具有用于dPCR擴增的多個腔室的微流控芯片，可以以非常高的精度和靈敏度來量化DNA甲基化異質性。開發了基于dPCR的多重DNA甲基化分析方法。第三，一些研究通過使用微流控芯片實現了靈敏的DNA甲基化分析，檢測極限極低。微流控技術使單細胞DNA甲基化分析成為可能。最后，在微流控芯片上可以實現DNA的高效富集。總之，微流控技術為傳統的DNA甲基化分析帶來了多方面的改進。在未來，還有一些方面可以進一步探索。首先，應開發具有多功能的微流控系統，以應對不同的臨床情況和需求。其次，預計將在微流控芯片上實現更多種類的傳統技術，這可能產生與當前方法相比具有競爭力的結果。關鍵的芯片上步驟，包括但不限于基因組DNA提取、亞硫酸氫鹽處理、擴增和檢測，需要優化以提高基于微流控的方法的競爭力。最后，開發高集成度和高通量的微流控方法仍有待進一步探索。在臨床診斷和治療領域，肯定需要改進DNA甲基化分析方法。微流控技術提供了一種很有前途的方法，可以以靈敏、便攜、快速、低成本和高通量的方式進行DNA甲基化分析。

論文鏈接： https://doi.org/10.1063/10.0023845



審核編輯：劉清