在德國(guó)巴德諾海姆的Max Planck心肺研究所，人們對(duì)斑馬魚(yú)的心血管系統(tǒng)進(jìn)行了研究。斑馬魚(yú)的透明度（圖1）及其實(shí)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)使其成為人體心血管系統(tǒng)的理想比例模型。

圖1 斑馬魚(yú)的照片。心臟位于紅色方塊內(nèi)

為了研究斑馬魚(yú)的血液流動(dòng)，血紅細(xì)胞被熒光蛋白DsRed標(biāo)記。熒光的強(qiáng)度受到附著在紅細(xì)胞上的熒光蛋白數(shù)量的限制。此外，光線(xiàn)發(fā)射的方向是隨機(jī)的，這進(jìn)一步減少了到達(dá)相機(jī)的光量。低光強(qiáng)度不一定存在問(wèn)題，增加曝光時(shí)間來(lái)捕捉足夠的光是一個(gè)常用的解決方法，這通常被用于成像固定的昏暗物體。然而，在移動(dòng)物體上使用相同的方法會(huì)導(dǎo)致圖像模糊。

試想一條活的斑馬魚(yú)，它的內(nèi)臟是在跳動(dòng)的。斑馬魚(yú)的心率約為每分鐘175次，或接近每秒3次。為了捕捉心跳的每個(gè)階段，需要較高的幀率，否則圖像會(huì)因運(yùn)動(dòng)模糊而失真。這意味著圖像傳感器非常短暫地暴露在昏暗的熒光燈下。通過(guò)增加激發(fā)光的強(qiáng)度來(lái)增加熒光燈的數(shù)量是不可行的，因?yàn)檫@會(huì)傷害魚(yú)類(lèi)。

圖2 HiCAM高速像增強(qiáng)熒光相機(jī)附在熒光顯微鏡上。

實(shí)驗(yàn)裝置

用安裝有Lambert HiCAM高速攝像系統(tǒng)的熒光顯微鏡對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行研究(圖2)。將魚(yú)固定在凝膠中，從下方照射。DsRed蛋白的熒光從紅細(xì)胞中發(fā)出。這種光向各個(gè)方向發(fā)射，其中一些光以相反的方向穿過(guò)激光的光路。但是，熒光通過(guò)二色鏡被定向到相機(jī)上，而不是被反射回光源。任何散射的激發(fā)光都被二色鏡反射。濾光片將去除任何背景光，只透射紅細(xì)胞熒光發(fā)出波長(zhǎng)的光。

圖像傳感器將捕捉進(jìn)來(lái)的熒光。捕捉將以每秒數(shù)百或數(shù)千幀的幀率下進(jìn)行，每幀的曝光時(shí)間數(shù)量級(jí)在幾毫秒到幾毫秒的一小部分。電子倍增ccd (emccd)傳感器的光靈敏度足以捕捉到微弱的熒光。但它們?cè)谌直媛氏轮荒軐?shí)現(xiàn)大約100fps的幀率，這對(duì)于目前的應(yīng)用來(lái)說(shuō)是不夠的。而cmos傳感器可以在更高的幀率下工作，在全分辨率下可達(dá)每秒數(shù)千幀。然而，在每幀較短的曝光時(shí)間內(nèi)，普通的高速CMOS傳感器無(wú)法記錄足夠的光量來(lái)達(dá)到合理的信噪比。

圖3 斑馬魚(yú)心臟中(圖像右下角)的紅細(xì)胞從一個(gè)腔室被運(yùn)送到下一個(gè)腔室(1-3)，并進(jìn)入主動(dòng)脈(5)。這里顯示的圖像是在間隔25毫秒的情況下記錄的。用500us的曝光時(shí)間以2000 fps的幀率進(jìn)行記錄。

HiCAM高速像增強(qiáng)熒光相機(jī)的優(yōu)點(diǎn)

HiCAM高速像增強(qiáng)熒光相機(jī)通過(guò)將高速CMOS傳感器與圖像增強(qiáng)器相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了所需的光靈敏度和高幀率。圖像增強(qiáng)器將檢測(cè)到的光子數(shù)量提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)。這樣，就可以以每秒2000幀的速度記錄斑馬魚(yú)的血液流動(dòng)。圖3顯示了斑馬魚(yú)心血管系統(tǒng)中紅細(xì)胞的流動(dòng)情況。

HiCAM高速像增強(qiáng)熒光相機(jī)-高靈敏度，幀頻可達(dá)4000幀/秒，實(shí)時(shí)熒光顯微成像的理想選擇！