快速、敏感和選擇性地檢測活病原體仍然是質量控制和風險評估的關鍵優先事項。而傳統方法往往需要復雜的工作流程、昂貴的試劑、實驗室設備，并且耗時，不適合現場檢測和在低資源環境的應用。開發低成本和快速的替代方法來檢測不同環境基質中的活病原體已引起越來越多的關注。其中，以小型化方式集成各種實驗室功能的微流控系統已被證明是一種有前途的病原體快速敏感檢測工具。

基于此，英國克蘭菲爾德大學（Cranfield University）楊竹根教授簡要總結了近年來發展起來的新型微流控系統，并就檢測時間、檢測限和目標生物等方面與傳統方法進行了比較，討論了專門用于檢測活病原體的微流控系統的發展。此外，該論文還展望了微流控系統用于活病原體檢測的前景，并重點討論了微流控系統在快速、低成本的現場檢測方面的應用潛力。

檢測活病原體的常規技術

盡管存在一些缺陷，例如無法檢測不可培養的細菌以及耗時耗力的檢測方案，但基于培養的微生物分析由于其高靈敏度、特異性和定量能力，仍然是活病原體檢測的金標準（圖1）。幾種市售檢測微生物指標（如大腸桿菌）的方法都是基于細胞培養方法。

該方法依賴于使用特定的生長培養基來選擇性地培養和分離感興趣的病原體。活細胞的檢測通過在固體培養基上培養菌落、測量液體培養物的光密度或直接使用顯微鏡計數細胞來實現，通常需要數天甚至數周才能得出結果，這取決于病原體形成可見菌落的能力。

此外，雖然陽性培養結果可以作為活體有機體的確鑿證據，但陰性培養結果不能作為樣本中沒有活細胞的證據。因此，檢測不可培養細菌（VNCB）活體仍然是最重要的挑戰之一，這可能導致臨床診斷（如藥物敏感性檢測）中的假陰性結果和危險后果。此外，常規的檢測技術不適用于低資源環境，因為它們需要昂貴的實驗室設施，而且訓練有素的人員可能需要幾天甚至幾周才能得出結果，這使得它們對于常規水質監測或快速追蹤疾病暴發等特定任務不切實際。

圖1檢測活病原體的常規技術

用于檢測活微生物的微流控系統

微流控系統可分為兩大類：微全分析系統（μTAS）和基于紙張的微流控分析系統（μPADs）。它們的制造方法不同，采樣和檢測組件也不同。μTAS的概念于1990年首次提出，它是在硅片上建立的集樣品預處理、分離和檢測于一體的液相色譜儀。μTAS的應用方向主要包括細胞組學、醫學診斷和環境監測，也被用于制藥的微反應器。μTAS的優點包括使用低樣本量和試劑量、降低檢測成本和檢測時間、簡化操作，以及與傳統檢測相比可以集成更多功能。

近年來，一些微流控阻抗生物傳感器已被開發用于檢測活的全細菌細胞。最近，Liu等開發了一種阻抗生物傳感器，用于檢測火雞食品樣品中兩種不同血清型的沙門氏菌細胞。該生物傳感器由一個玻璃芯片和兩個檢測區域組成，檢測區域由含有固定化抗沙門菌抗體的微間隙叉指電極（IDE）陣列構成，用于阻抗測量，以檢測細胞的存在/缺失（圖2A）。

該傳感器包含兩個感應IDE陣列，每一個都有針對特定沙門氏菌血清型的不同抗體。使用注射泵將樣品通過抗原入口注入，之后放置半小時，使抗體與沙門氏菌細胞結合，然后進行后續洗滌步驟。隨后使用阻抗分析儀測量阻抗并且將其與樣品注入前獲得的測量結果進行比較。這樣，阻抗測量的差異就對應于樣品中存在的細胞濃度。

圖2 用于檢測活微生物的微流控系統

代謝活性與細胞培養

目前，有許多市售檢測方法通過比色法、熒光法和生物發光法檢測代謝活性或細胞分裂，以確定樣品中是否存在活病原體。這些方法需要較長的檢測時間和復雜的工作流程。微流控系統可以極大地將檢測方案小型化和自動化，這可能是一種改善活細胞檢測的有用方法。

ATP是最常用的細胞活力生物標志物之一，然而，將ATP測量納入微流控系統的工作很少。Lee等人開發了一種用于實時檢測氣溶膠中ATP的生物傳感器。將一個氣溶膠冷凝系統耦合到一個硅微流控芯片和一個生物發光傳感器中，冷凝過程允許氣溶膠樣本快速濃縮和水解，然后插入微流控通道，裂解緩沖液和D-熒光素-熒光素酶試劑通過單獨的入口被引入。

隨后，通過微流控通道將試劑與細菌細胞混合，使游離ATP與D-熒光素-熒光素酶發生反應，并將混合物運輸到檢測區域，在檢測區域使用電路測量生物發光強度（圖3）。

圖3 代謝活性與細胞培養

總體而言，在活細胞檢測方面，利用微流控系統進行的研究工作還非常有限，主要集中在阻抗傳感器、ATP檢測和液滴細胞培養等。然而，仍有一些不同的技術，如RNA檢測、蛋白質合成、熱流監測等，其集成到微流控系統的潛力仍有待探索。隨著最近SARS-COV-2的暴發，全球為改善病毒診斷技術而做出的努力迅速增加。使用基于阻抗的微流控系統根據病毒包膜的完整性來區分傳染性和非傳染性病毒顆粒，是一個需要進一步研究的領域，可能在臨床和流行病學研究中有很大用途。

審核編輯：劉清