傳染性細菌和病毒，如嚴重急性呼吸綜合征（SARS）、中東呼吸綜合征（MERS）冠狀病毒（MERS- CoV）、埃博拉病毒、SARS- CoV -2、登革熱病毒、肺結核等，給人類健康帶來了災難性的后果和威脅。到目前為止，診斷這些病原體的金標準方法依賴于這些病原體每個獨特基因的PCR擴增子熒光讀出。同時，分子診斷結果的納米孔讀出正在迅速發展，并探索了許多可能性。由于納米孔計數器具有計數短DNA雙鏈的能力，而PCR可以產生大量設計長度的DNA雙鏈，因此將這兩種技術結合在一起比較直觀。

近日，廣州大學化學化工學院王家海教授團隊聯合廣州市疾病預防控制中心何榮研究員、中國地質大學夏帆教授團隊在納米孔傳感領域取得重要進展，開發了納米孔計數器耦合PCR技術檢測多種病毒核酸的方法，成果以“Bare glassy nanopore for length-resolution reading of PCR amplicons from various pathogenic bacteria and viruses”為題發表在國際知名學術期刊Talanta上。王家海教授、何榮研究員和夏帆教授為共同通訊作者，李慧珍副教授為第一作者，廣州大學為第一通訊單位。

圖1 玻璃狀納米孔檢測細菌或病毒基因PCR擴增產物方法示意圖

該研究采用玻璃狀納米孔，在不添加任何有機添加劑或填充水凝膠的情況下，全面研究了199 ~ 2996堿基對范圍內DNA雙鏈的長度依賴性分辨率。研究發現，玻璃狀納米孔具有極好的區分至少200個堿基對分離的DNA雙鏈的能力。長度大于2000堿基對的DNA雙鏈堵塞電流峰值分布較寬，不適合進行多路復用研究。因此，多路復用研究的最佳選擇是基于200 ~ 2000個堿基對的雙鏈長度范圍。長度在200到2000堿基對之間的DNA雙鏈的納米孔易位具有最好的電流特征，在定量和定性結果方面具有顯著的性能。

此外，研究結果表明，5個不同長度、間隔超過200個堿基對的PCR擴增子，分別對應于Lambda DNA基因組的不同片段，可以同時被解析。設計長度的每個DNA雙鏈的電流特征表明，較長的DNA雙鏈具有較大的阻塞電流峰值幅值中值。此外，基于玻璃狀納米孔的長度分辨能力，可以在高分辨率下識別臨床樣本中包括SARS-CoV-2在內的各種致病菌和病毒。該產品的電子讀出可以省去探針設計和熒光標簽，在沒有任何其他信號轉換器（CRISPR-Cas12）的情況下，其檢出限可降至7.5 aM，如實反映了PCR擴增的效率。

圖2玻璃狀納米孔對病毒或細菌四種不同基因PCR產物的鑒別能力



圖3玻璃狀納米孔SARS-CoV-2 Delta突變體中5個不同基因PCR產物的鑒別能力






審核編輯：劉清