一直以來，病原體快速和多重檢測都是全球衛生安全領域關注的重點方向。在現有檢測方法中，二代測序（NGS）可提供病原體詳細信息，但檢測時間久且成本高；PCR技術可以實現病原體多重檢測，但熒光探針發射光譜經常重疊，且易混淆識別目標，使單次可檢病原體數量受限；而當前被廣泛使用的、基于CRISPR技術所研發的高特異和高靈敏分子診斷方法（CRISPR-Dx）也存在多重檢測受限和高成本等問題。

基于以上挑戰，中國科學院精密測量院楊運煌團隊展開研究，于近期在Nature Communications上發表了題為“Microfluidic space coding for multiplexed nucleic acid detection via CRISPR-Cas12a and recombinase polymerase amplification”的文章，提出一種名為“MiCaR”的高性能多靶標檢測平臺。

“MiCaR”平臺檢測原理

“MiCaR”多靶標核酸檢測技術基于微流控空間編碼和CRISPR-Dx技術，可在40分鐘內檢測30種不同的病原體，靈敏度達到了0.26 aM。“MiCaR”檢測平臺特點可總結為：（1）有效且正確擴增多個（如 ≥ 4個）核酸靶點；（2）在合適的溫度下擴增和識別靶標；（3）精確識別靶標，不受任何干擾；（4）準確區分信號并將其與對應靶標進行關聯。研究人員通過有效地檢測9價HPV疫苗對應的9種HPV亞型，證明了“MiCaR”的實用性以及其在感染性疾病診斷和流行病學監測方面的潛力和應用價值。

“MiCaR”平臺HPV檢測流程

研究人員以HPV亞型檢測為例，演示了“MiCaR”平臺的使用流程。首先進行取樣，加熱樣本釋放核酸，將釋放的核酸直接進行重組酶聚合酶擴增（RPA），最后將擴增產物和CRISPR檢測液加入到放射狀芯片（SS-Chip）中，加熱后讀取結果。其中SS-Chip由30個孔位輪狀輻射分布并與中央孔位相連，CRISPR檢測液提前加入30個孔位，樣本從中央孔位加載，每個孔位都能獨立進行CRISPR檢測。

“MiCaR”平臺對九種HPV亞型檢測

為驗證“MiCaR”平臺對九價疫苗里9種HPV病毒亞型檢測能力，該研究將含有9種HPV亞型各自特定片段的質粒和9種crRNA進行交叉反應，結果顯示其檢測特異性高（如下圖所示）；制備9種不同濃度的HPV亞型靶標質粒（10?12 M、10?13 M、10?1? M、10?1? M、10?1? M、10?1? M、10?1? M、0 M）驗證其靈敏度，結果顯示對所有靶標檢測限達10?1? M至10?1? M。

9種HPV質粒和9種crRNA交叉實驗

進一步對100例HPV臨床樣本分型檢測，結果顯示“MiCaR”檢測性能良好，陽性和陰性預測一致性分別為97.8%和98.1%，靈敏度和特異性分別為97.8%和98.1%。

HPV臨床檢測（紅色）和“MiCaR”檢測（綠色）結果比對

對八種呼吸道病毒檢測板（RVP）進行檢測

研究基于“MiCaR”的方法檢測8種最具臨床相關性的呼吸道病毒，包括B型流感病毒（FLUBV）、人冠狀病毒NL63（HCoV-NL63）、人冠狀病毒OC43（HCoV-OC43）、人呼吸道合胞病毒（HRSV）、人冠狀病毒HKU1（HCoV-HKU1）、SARS-CoV-2、人副流感病毒3型（HPIV-3）和人偏肺病毒（HMPV），通過對8種RVP靶標質粒與8種crRNA進行交叉反應實驗，和對8種RVP靶標混合質粒與8種crRNA分別進行CRISPR檢測，結果均表明“MiCaR”對RVP靶標檢測強特異性，進一步證明“MiCaR”方法可以作為一種多病原體核酸檢測的通用平臺。

8種RVP靶標檢測特異性結果

該研究團隊表示，“MiCaR”充分展現了多重RPA的擴增、CRISPR/Cas12a系統在靶標識別方面的高特異性，以及微流控裝置在液體處理方面的顯著作用。該研究雖然只通過9種HPV亞型和8種呼吸道病毒驗證“MiCaR”檢測平臺的通用性，但其單次檢測靶標數量可達30個。團隊將繼續優化“MiCaR”擴增和檢測條件及微流控裝置，以實現一管法和自動化操作。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41467-022-34086-y

審核編輯：劉清