新冠病毒肺炎（COVID-19）抗原檢測的主要生物標記物是尖峰蛋白（S）和核衣殼蛋白（N），S蛋白包含兩個亞基——S1和S2。S1蛋白包含一個獨特的受體結合域（SRBD），可與人血管緊張素轉換酶2（ACE2）特異性相互作用，進一步介導宿主細胞識別。SRBD是開發新冠病毒特異性識別傳感探針的理想目標。N蛋白是新冠病毒最豐富的結構蛋白，并且它顯示出很強的免疫原性，通常作為COVID-19檢測的生物標志物。

圖1 新型冠狀病毒結構

近日，期刊Chemical Communications在線刊登蘇州系統醫學研究所張連軍研究團隊聯合瑞士蘇黎世聯邦理工學院王京研究團隊的研究成果（Rapid and sensitive multiplex detection of COVID-19 antigens and antibody using electrochemical immunosensor-/aptasensor-enabled biochips），詳細介紹了一種基于電化學傳感器的生物芯片，可對COVID-19抗原和抗體進行快速、靈敏的多重檢測。

圖2（a）所示為基于電化學傳感器的生物芯片渲染圖，其中包含多個獨立的傳感器。根據工作電極上包被生物標記物的不同，傳感器分為電化學免疫傳感器（electrochemical immunosensor）和電化學核酸適配體傳感器在（electrochemical aptasensor）。

對于電化學免疫傳感器，選擇新冠病毒S1-IgG抗體和S1蛋白作為傳感器識別元件，分別識別拭子樣本中的S1蛋白和血液樣本中的S1-IgG抗體。

對于電化學核酸適配體傳感器，通過SELEX方法篩選的兩個S1蛋白特異性核酸適配體（RBD-Ap-1、RBD-Ap-2）和一個N蛋白特異性核酸適配體（N-Ap），將其固定在傳感器上，以捕獲S1蛋白和N蛋白。

圖2 （a）可多重檢測新冠病毒S蛋白、N蛋白及IgG抗體的電化學生物傳感器陣列方案；（b）ELISA評估核酸適配體與新冠靶抗原的結合時間、最小自由能二級結構和核酸適配體的解離常數（Kd）；（c）核酸適配體的交叉反應性驗證。

為了制備電化學免疫傳感器，研究人員將S1-IgG抗體和S1蛋白共價固定在金納米顆粒絲網印刷電極（AuNP-SPE）表面，并進行一系列的表面修飾，具體步驟如下：

（1）在工作電極上滴加20μl 10mM半胱胺（巰基乙胺，cysteamine）溶液以引入-NH?基團，孵育2小時后，使用PBS-T緩沖液（0.05% Tween20溶于1 × PBS溶液中，pH=7.4）進行表面清洗；

（2）將20μl 2.5%戊二醛（在PBS-T緩沖液中制備）溶液滴加到工作電極表面，孵育15分鐘后，使用PBS-T溶液清洗；

（3）將20μl 50μg/ml新冠病毒特異性生物標記物（S1-lgG或S1蛋白，在PBS-T中制備）滴加在工作電極表面，孵育2小時以進行席夫堿（Schiff base）反應，然后用PBS-T緩沖液進行表面清洗。再將20μl 0.5 M乙醇胺（2-羥基乙胺，2-Aminoethanol）溶液滴加在工作電極表面，孵育15分鐘后，用PBS-T緩沖液進行表面清洗，用乙醇胺的-NH?滅活未反應的-CHO；

（4）將20μl 1%BSA溶液（在PBS-T緩沖液中制備）滴加到工作電極表面，孵育15分鐘后，使用PBS-T緩沖液清洗；

（5）制備的電化學免疫傳感器用氮氣干燥，封口膜密封，-20°C避光儲存。

圖3 電化學免疫傳感器表面修飾步驟示意圖

為了制備電化學核酸適配體傳感器，研究人員將COVID-19抗原特異性單鏈DNA核酸適配體（ssDNA aptamer）探針共價固定在金納米顆粒絲網印刷電極（AuNP-SPE）表面，并進行一系列的表面修飾，具體步驟如下：

（1）將75μl 1μM硫醇化ssDNA aptamer探針與2μl 5mM TCEP（硫醇類還原劑）混合，在室溫下孵育60分鐘以減少二硫鍵；

（2）在工作電極上滴加20μl 1μmol核酸適配體探針溶液，然后避光孵育2h以固定探針；

（3）用PBS緩沖液清洗電極，然后在工作電極上滴加20μl 2mM新鮮制備的MCH溶液，室溫下避光孵育2h，然后用去離子水清洗；

（4）制備的電化學核酸適配體傳感器用氮氣干燥，封口膜密封，-20°C避光儲存。

圖4 電化學核酸適配體傳感器表面修飾步驟示意圖

圖5 核酸適配體（探針）的序列

總體而言，該研究工作中基于電化學傳感器的生物芯片在COVID-19檢測方面表現出較為優異的性能，例如：更低的檢測限、更廣的檢測范圍、更高的靈敏度、較短的響應時間及較好的選擇性等等，有望成為COVID-19檢測（家庭自檢、社區快速診斷）的一把“利器”。

圖6 COVID-19檢測方法匯總及檢測性能比較

論文鏈接：

https://doi.org/10.1039/D2CC01598F

審核編輯 ：李倩