自2019年12月以來, 全球流行的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）已感染過億人，并導致了近2500萬人死亡?，F在全球報告的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）病例數已經連續五周下降，表明即使存在病毒變體，簡單的公共衛生措施（大規模篩查和主動隔離）仍能發揮作用。對于大規模篩查而言，需要高靈敏、高通量和低成本的檢測方法以識別感染者和追蹤潛在感染者，改善局部控制能力，并為區域疾病控制工作提供依據。RT-qPCR方法是COVID-19診斷的金標準方法，卻受限于訓練有素的人員和昂貴的儀器需求，而無法在欠發達國家和地區廣泛應用。因此亟需快速、靈敏、無需專業人員操作和復雜設備的COVID-19高通量測試方法以擴展COVID-19的診斷能力。

近來，美國杜蘭大學醫學院分子診斷中心的胡曄教授和寧波教授報道了一種基于CRISRP技術的超靈敏、高通量COVID-19熒光診斷系統（CRISPR-FDS, CRISPR-based fluorescent detection system)。相關研究以“Ultra-sensitive and high-throughput CRISPR-powered COVID-19 diagnosis”為題發表在國際權威期刊雜志《Biosensors and Bioelectronics》上（DOI:10.1016/j.bios.2020.112316）。南昌大學博士研究生黃震為該論文的第一作者。

研究的主要內容介紹

CRISPR-FDS利用一步RT-PCR技術擴增從樣品提取的病毒RNA目標片段（ORF1ab 和N基因），將所得的擴增子整體轉移至基于gRNA/Cas12a的CRISPR系統中進行熒光檢測。目標特異性的gRNA將引導Cas12a蛋白特異性切割目標基因，同時非特異性切割單鏈熒光探針以釋放熒光信號。該方法也兼容RPA等恒溫擴增技術，可將檢測時間縮短至50分鐘。CRISRP-FDS于其他非SARS-CoV-2病原體無交叉，且檢測限低至2 拷貝/反應，較RT-qPCR優勢明顯。且與臨床實驗室進行RT-qPCR測試相比，針對同樣的COVID-19疑似病例鼻拭子樣本進行測試，CRISRP-FDS方法表現出更高的靈敏度和穩定性。

CRISPR-FDS 診斷流程。該方法兼容拭子，唾液和血液等多種標本，即可應用于大規模篩查，也可實現POCT檢測，且具有極大的臨床應用潛力。

值得注意的是，CRISPR-FDS采用了大多數臨床實驗室中容易獲得的試劑和設備，可以很容易地實現自動化，以滿足對高通量測試的需求。而且，胡教授團隊進一步整合CRISPR-FDS技術和微流控芯片技術，實現了基于智能手機讀取的唾液POCT測試（Science advances, DOI: 10.1126/sciadv.abe3703）以提升欠發達地區的測試能力。另外，胡教授團隊基于CRISPR-FDS技術定量追蹤感染者血液中的病毒RNA，臨床研究表明該技術可以改善COVID-19診斷，用于SARS-CoV-2感染清除的評估，并預測感染的嚴重程度（Journal of Clinical Investigation, DOI: 10.1172/JCI146031）。

小結

CRISPR-FDS具有超高的靈敏度和特異性，簡單，穩定且無需昂貴的儀器，適用于COVID-19的大規模篩查。基于該技術的唾液POCT測試可以進一步擴展其應用場景，提升欠發達地區的檢測能力。而且臨床驗證已經表明，CRISPR-FDS具有重大的臨床應用價值以評估SARS-CoV-2的清除和預測疾病嚴重程度。

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