近日，中科院長(zhǎng)春光機(jī)所應(yīng)用光學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用微流控技術(shù)，將微滴生成、PCR擴(kuò)增和熒光檢測(cè)等環(huán)節(jié)進(jìn)行集成，運(yùn)用連續(xù)流動(dòng)式PCR擴(kuò)增方法，實(shí)現(xiàn)了“樣本進(jìn)、結(jié)果出”的一體化數(shù)字PCR系統(tǒng)。

數(shù)字PCR也叫Digital PCR（dPCR），是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于傳統(tǒng)熒光定量PCR(qPCR)來(lái)說(shuō)，dPCR對(duì)結(jié)果的判定不依賴(lài)于擴(kuò)增曲線(xiàn)循環(huán)Ct值，不受擴(kuò)增效率的影響，能夠直接讀出DNA的分子個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣本核酸分的子絕對(duì)定量。dPCR一般包括三部分內(nèi)容，即樣本離散、PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)分析。與傳統(tǒng)技術(shù)不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬(wàn)個(gè)單元。每一個(gè)反應(yīng)單元獨(dú)立進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。不同于qPCR對(duì)每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)定的方法，dPCR技術(shù)是在擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集。最后通過(guò)直接計(jì)數(shù)或泊松分布公式計(jì)算得到樣品的原始濃度或含量。針對(duì)這一檢測(cè)流程，提出了一種連續(xù)流動(dòng)式、全自動(dòng)、一體化集成數(shù)字PCR系統(tǒng)，只需要一次進(jìn)樣就可同步實(shí)現(xiàn)微液滴生成、熱循環(huán)擴(kuò)增以及核酸絕對(duì)定量分析的整個(gè)dPCR檢測(cè)流程。

圖1 數(shù)字PCR原理及檢測(cè)過(guò)程

如圖2所示該系統(tǒng)主要由液滴生成及流體驅(qū)動(dòng)裝置、PCR擴(kuò)增芯片及溫度控制裝置、數(shù)字液滴熒光檢測(cè)裝置組成。雙路高精度注射泵驅(qū)動(dòng)水相與油相液體經(jīng)Y型液滴生成裝置，產(chǎn)生包裹有單分子級(jí)別DNA的液滴；液滴沿Teflon管道連續(xù)流過(guò)多個(gè)恒溫加熱區(qū)，從而實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增；利用470 nm光源激發(fā)反應(yīng)后液滴內(nèi)的熒光探針，并由CMOS進(jìn)行信號(hào)的捕捉。該系統(tǒng)將全部檢測(cè)流程集成于一臺(tái)設(shè)備內(nèi)，由鋰電系統(tǒng)為整個(gè)系統(tǒng)供能，并設(shè)計(jì)了相配套的上位機(jī)控制及數(shù)據(jù)分析軟件。與傳統(tǒng)由多臺(tái)設(shè)備共同組成的dPCR檢測(cè)系統(tǒng)不同，該系統(tǒng)無(wú)需在實(shí)驗(yàn)中途進(jìn)行人工樣本轉(zhuǎn)移等操作，只需將待檢測(cè)樣本加入該系統(tǒng)，就可得到樣本的定量檢測(cè)結(jié)果。

圖2 系統(tǒng)組成示意圖

研究團(tuán)隊(duì)利用該系統(tǒng)完成了人體血清內(nèi)HBV病毒的定量檢測(cè)，對(duì)病毒濃度為

103- 105IU/mL的血清樣本進(jìn)行測(cè)試，其液滴熒光強(qiáng)度分布與分布頻率如圖3所示，可以看出，隨模板濃度逐漸增高，其陰性液滴占比也逐漸減少。如圖4所示，液滴統(tǒng)計(jì)結(jié)果通過(guò)泊松分布校正，可計(jì)算出模板中DNA分子的絕對(duì)濃度，并與商用定量PCR儀結(jié)果進(jìn)行比較，從圖5可以看出，其結(jié)果具有很強(qiáng)的線(xiàn)性相關(guān)度，經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果具有較高的可重復(fù)性和定量精度。

圖3 (a-c)液滴熒光強(qiáng)度分布及頻率分布 (d)液滴熒光圖像

圖4 樣本濃度檢測(cè)結(jié)果

圖5 dPCR與qPCR檢測(cè)結(jié)果的比較

綜上所述，該系統(tǒng)具有較高的集成度和自動(dòng)化程度，在便攜性和操作難易程度上具有一定的優(yōu)勢(shì)，為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。該系統(tǒng)在低水平病原體檢測(cè)、病毒載荷絕對(duì)定量、罕見(jiàn)等位基因檢測(cè)、拷貝數(shù)變異分析等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。相關(guān)工作以“Fully automatic integrated continuous-flow digital PCR device for absolute DNA quantification”為題發(fā)表于《Analytica Chimica Acta》。