最近，一支來自北美和歐洲的科學(xué)家團(tuán)隊開發(fā)了一種創(chuàng)新的生長和成像平臺，稱為 GLO-Roots，可以研究土壤生長植物的根系結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)。

GLO-Roots是卡內(nèi)基科學(xué)研究所(加利福尼亞州斯坦福)的 José Dinneny 博士實驗室、Rubén Réllan-álvarez 博士(墨西哥朗格比奧)和比利時列日大學(xué)的 Guillaume Lobet 博士實驗室的合作成果。研究人員在 BioImaging Solutions, Inc.(加利福尼亞州圣地亞哥)的幫助下設(shè)計和建造了新的生長和成像平臺，支持幾種模式生物，即擬南芥、二穗短柄草、狗尾草和番茄。

GLO-Roots 采用基于發(fā)光的報告子和一對普林斯頓儀器背照式 CCD 相機(jī)，用于研究土壤中生長的遮光根的根結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)模式。定制設(shè)計的圖像分析算法允許對土壤特性、基因表達(dá)和根系結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行空間整合。GLO-Roots 開發(fā)人員聲稱，新平臺可以提供巨大的實用性，以喚起自然的適應(yīng)性反應(yīng)的方式向根系呈現(xiàn)環(huán)境刺激，并提供研究此類過程多維性質(zhì)的工具。

本應(yīng)用說明將概述 GLO-Roots 團(tuán)隊進(jìn)行的一些研究，該團(tuán)隊由斯坦福大學(xué)卡內(nèi)基科學(xué)研究所植物生物學(xué)系的 José Dinneny 博士領(lǐng)導(dǎo)

GLO-Roots 設(shè)置

GLO-Roots 平臺由 四部分組成：(1)生長容器，稱為根管，允許植物在土壤中生長并對根部進(jìn)行成像;(2)基于發(fā)光的報告器，可以追蹤活植物根部生物學(xué)的各個方面;(3) GLO1，一種旨在自動對根管進(jìn)行成像的發(fā)光成像系統(tǒng); ( 4 ) GLO-RIA，一種旨在量化利用 GLO1 成像的根系的圖像分析套件。2圖 1 顯示了使用 GLO-Roots 平臺的實驗設(shè)置示例。

圖 1. GLO-Roots 生長和成像系統(tǒng)。(A)根管不同物理組件的三維表示，包括塑料蓋、聚碳酸酯板、墊片和橡膠 U 型通道。(B)根管中 35 天大的植物，黑色蓋子已移除。(C)帶有 11 個根管的容納箱的頂視圖。(D)本研究中使用的不同熒光素酶的體內(nèi)發(fā)射光譜。表達(dá)所示轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因純合株系在瓊脂培養(yǎng)基上生長 8 天。將熒光素 (300 μM) 噴灑在幼苗上;將培養(yǎng)皿放在黑暗中，然后在 500 至 700 nm 的波長范圍內(nèi)成像 2 秒。從不同幼苗根部的不同部位獲取五個強(qiáng)度值并取平均值。相對比較大強(qiáng)度值顯示在右下圖中。(E) GLO1 成像系統(tǒng)由兩臺Princeton Instruments PIXIS:2048 背照式 CCD 相機(jī) (a)組成，冷卻至 -55°C。濾光輪(b)允許對不同的熒光素酶進(jìn)行光譜分離。右側(cè)是根管支架(c)用于將根管器定位在攝像機(jī)前面。步進(jìn)電機(jī)(d)將根管器旋轉(zhuǎn) 180° 以對兩側(cè)進(jìn)行成像。(F)在根管器的兩側(cè)分別對表達(dá)報告基因 ProUBQ10:LUC2o 的 21 DAS(即播種后 21 天)植物進(jìn)行成像;發(fā)光信號以綠色或洋紅色表示側(cè)面。面板中間顯示了兩側(cè)的組合圖像。插圖顯示了根系的放大部分。

圖表、照片和數(shù)據(jù)由卡內(nèi)基科學(xué)研究所的 José Dinneny 博士提供。首次發(fā)表于 R. Rellán-álvarez 等人 2015 年?！癎LORoots：一種能夠多維表征土壤生長根系的成像平臺?！眅Life 4 (1): e07597。

雖然大多數(shù)用于生物醫(yī)學(xué)研究的商用發(fā)光成像系統(tǒng)都針對水平放置的標(biāo)本或微量滴定板中的樣品進(jìn)行了優(yōu)化，但將根管置于此位置會引發(fā)植物的重力反應(yīng)。因此，GLO-Roots 使用定制設(shè)計的成像系統(tǒng)(稱為生長和發(fā)光觀測站 1，或簡稱為 GLO1)，該系統(tǒng)已針對GLO-Roots 根管中的雙報告熒光素酶表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化。

兩臺PIXIS:2048 背照式 CCD 相機(jī)(來自普林斯頓儀器公司)相互疊放，以便捕捉根管的部分重疊圖像，同時電動平臺自動旋轉(zhuǎn)根管以捕捉兩側(cè)的圖像(參見圖 1E)。然后根據(jù)捕捉到的兩側(cè)圖像生成合成圖像。圖 1F 顯示，每側(cè)大約有一半的根系顯露出來，兩側(cè)都有一些根系可見。土壤層足夠厚，可以阻擋部分根系的光線，但又足夠薄，可以確保其連續(xù)結(jié)構(gòu)可以從對面視圖進(jìn)行編譯。整個 GLO1 成像系統(tǒng)封閉在一個不透光的黑匣子中，該黑匣子配有門，可以裝載和卸載根管。

PIXIS:2048B 相機(jī)不僅為 GLO-Roots 研究人員提供了所需的空間分辨率和視野，還提供了檢測所用不同報告基因的發(fā)射波長所需的出色低光照靈敏度。表 1 列出了用于擬南芥相關(guān) GLO-Roots 研究的熒光素酶。

數(shù)據(jù)和結(jié)果

根系會發(fā)育出不同的根系類型，每種根系都能感知無數(shù)的局部環(huán)境線索，并將其環(huán)境信息與系統(tǒng)信號整合在一起。這種高度復(fù)雜的多維輸入融合使得根系生長速度、方向和代謝活動能夠不斷調(diào)整，從而形成一個動態(tài)的物理網(wǎng)絡(luò)。

圖 2 展示了使用 GLO1 系統(tǒng)捕獲的擬南芥根系的延時成像以及使用 GLO-RIA 圖像分析套件進(jìn)行的量化。

圖 2. 擬南芥根系延時成像并使用 GLO-RIA 進(jìn)行量化。(A)ProUBQ10:LUC2o Col-0 植物的典型每日延時圖像系列(11 至 35 DAS)。(B)使用 GLO-RIA 中實現(xiàn)的方向性插件計算出按時間序列成像的三個根系的平均方向性(如圖 A 所示)。(C)使用圖 A 中的圖像對根系生長進(jìn)行顏色編碼投影。(D)根系深度、寬度和面積是根據(jù)凸包自動計算的，凸包由 GLO-RIA(n = 3)半自動確定。手動量化了主根長度、側(cè)根數(shù)以及側(cè)根數(shù)除以主根長度。使用具有 95% 置信區(qū)間(灰色)的局部多項式回歸擬合來表示方向性分布曲線。0° 是重力矢量的方向。

圖表、照片和數(shù)據(jù)由卡內(nèi)基科學(xué)研究所的 José Dinneny 博士提供。首次發(fā)表于 R. Rellán-álvarez 等人 2015 年的論文“GLORoots：一種能夠多維表征土壤中生長的根系的成像平臺。”eLife 4 (1): e07597。

在這里，可以通過植物發(fā)育的后期階段觀察到方向性等根系特征(注意圖 2A 和 2B 中分別顯示的 35 DAS 根系圖像和 35 DAS 方向性分析)。圖 2A 和圖 3 顯示了播種后11 至 21 天的擬南芥種質(zhì) Col-0 根表達(dá)報告基因 ProUBQ10:LUC2o 的時間序列;圖 2C 顯示了顏色編碼的時間投影。

方向性分析表明，隨著側(cè)根成為主要根系類型，根系角度逐漸變化，從 0°(垂直)到 55°。圖 2D 顯示了GLO-RIA 可以自動捕獲的幾種根系特征(深度、寬度、面積)以及手動量化的其他特征(主根生長率或每個主根的側(cè)根數(shù)量)隨時間的變化。

到目前為止，GLO-Roots 團(tuán)隊已經(jīng)發(fā)表了關(guān)于根系生長連續(xù)成像的數(shù)據(jù);不同擬南芥種質(zhì)的根系結(jié)構(gòu);利用光譜上不同的熒光素酶來捕獲與基因表達(dá)模式、根系相互作用表征和微生物定植相關(guān)的其他信息;在缺水、缺磷和光照條件下根系結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性變化; GLO-Roots 平臺是否適合研究其他植物物種;等等。研究團(tuán)隊還對發(fā)現(xiàn)其他環(huán)境刺激如何影響根系生長以及這些反應(yīng)在擬南芥不同種質(zhì)之間是否不同非常感興趣。

圖 3：在對照條件下生長的表達(dá) ProUBQ10:LUC2o 的 Col-0 植物從 11 天到 21 天的視頻延時時間戳。視頻由卡內(nèi)基科學(xué)研究所的 José Dinneny 博士提供。首次發(fā)表于 R. Rellán-álvarez 等人 2015 年?！癎LO-Roots：一種能夠多維表征土壤生長根系的成像平臺?！眅Life 4 (1): e07597。

欲了解更多數(shù)據(jù)和深入討論結(jié)果，請參閱 R. Rellán-álvarez 等人 2015 年的論文“ GLO-Roots：一個能夠多維表征土壤中生長的根系的成像平臺。 ”eLife 4 (1): e07597。

使能技術(shù)

GLO1 成像系統(tǒng)中集成的每臺PIXIS:2048 相機(jī)均采用背照式傳感器 CCD，其大型感光陣列由2048 x 2048 像素組成(見圖 3)。通過采用普林斯頓儀器獨有的XP 冷卻技術(shù)，這些四百萬像素相機(jī)通過全金屬密封設(shè)計實現(xiàn)了低至 -70°C 的熱電冷卻。這種創(chuàng)新的冷卻技術(shù)可確保免維護(hù)運行 ，并由業(yè)內(nèi)唯一的終身真空保證提供支持。

圖 4：普林斯頓儀器公司的 PIXIS：2048 CCD 相機(jī)具有出色的靈敏度和寬闊的視野。

除了 XP 有助于很大程度地減少熱產(chǎn)生的(暗)噪聲外，極高的量子效率和超低噪聲電子元件使 PIXIS:2048 相機(jī)成為要求嚴(yán)格的低光照成像應(yīng)用的理想選擇。雙速操作(即 100 kHz 或 2 MHz)允許在穩(wěn)態(tài)和快速動力學(xué)研究中使用。

為了優(yōu)化從 UV 到 NIR 應(yīng)用的定量科學(xué)成像性能，PIXIS:2048 平臺支持前照式CCD 格式、背照式格式、具有高 UV 靈敏度的背照式格式以及具有高 NIR 靈敏度的背照式格式(請注意，普林斯頓儀器利用其專有的eXcelon? 處理和背照式深耗盡技術(shù)，在 NIR 中提供比較高靈敏度，同時抑制標(biāo)準(zhǔn)背照式 CCD 中發(fā)生的 etaloning)。PIXIS 系列支持其他幾種適用于各種成像和光譜應(yīng)用的 CCD 陣列尺寸。

使用普林斯頓儀器公司最新版的 64 位 LightField? 數(shù)據(jù)采集軟件(可選)可以輕松完全控制所有 PIXIS 硬件功能。通過極其直觀的 LightField 用戶界面，可以實現(xiàn)一系列新功能，輕松捕獲和導(dǎo)出圖像數(shù)據(jù)。

審核編輯 黃宇